考前必看：CRISPR/Cas9基因编辑技术专题

 

来源公众号：生命教育观察

2020年诺贝尔化学奖授予来自法国的埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和美国科学家詹妮弗·杜德纳（Jennifer Anne Doudna），以表彰她们在“开发基因组编辑方法”方面作出的贡献——CRISPR/Cas9基因剪刀(CRISPR/Cas9 genetic scissors)。

1. CRISPR是指核酸序列中的簇状规则间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats），缩写为CRISPR。

2.Cas是什么？ CRISPR相关（CRISPR-associated），缩写为cas。Cas基因与编码已知蛋白质的基因非常相似，可以专门用于解旋和切割DNA。

 CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。

新人教版·必修2（P85）

相关试题

1.(2025·山东青岛调研)CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，Cas9蛋白能与人工设计的sgRNA形成复合体(如图)。利用该技术可以对DNA进行一系列的定向改造。下列相关叙述错误的是(　　)

A.Cas9蛋白属于限制酶，能切割目的基因

B.sgRNA具有能与目的基因发生碱基互补配对的结构

C.基因编辑技术能够定点插入、删除或替换部分碱基对

D.通过基因编辑技术引起的变异属于基因重组

1.答案　D

2.（2016江苏）近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割(见下图)。下列相关叙述错误的是(　　)

A．Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成，作用是破坏磷酸二酯键

B．向导RNA与基因形成的双链区也要遵循碱基配对原则

C．向导RNA可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸

D．若α链剪切点附近序列为5′－TCCACAATC－3′，则相应的识别序列为5′－UCCACAAUC－3′

2.答案 C

3.(2025·山东烟台调研)猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如图所示。下列叙述错误的是(　　)

A.培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染

B.Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割

C.改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植

D.通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因

3.答案　B

4、我国科学家黄三文团队通过基因编辑技术培育出二倍体自交系和杂交优势显著的杂交马铃薯品系“优薯1号”，突破了百年来马铃薯自交不亲和薯块只能无性繁殖的难题。下图是科学家用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除二倍体马铃薯的自交不亲和基因的示意图。  

（1）据图分析CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA引导Cas9蛋白到__________进行切割。已知CRISPR/Cas9仅存在于原核生物，故需借助__________技术才能在马铃薯细胞中发挥作用。Cas9蛋白和向导RNA结合形成的复合物结合后能切割DNA，从功能上来看该复合物相当于基因工程中的限制酶，CRISPR/Cas9打破了限制酶__________的局限性。所以在使用CRISPR/Cas9系统对不同基因进行编辑时，应使用__________（填“相同”或“不同”）的向导RNA。 

（2）敲除二倍体马铃薯的自交不亲和基因后可让该植株自交观察是否产生种子来检测其作用效果，这属于__________水平的鉴定。 （3）基因编辑技术比传统的基因工程技术更准确，目的性更强。通过上述材料，推测利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行基因敲除的应用价值可能有__________（答出一点即可） 

4.答案：（1）一个特定的基因位点    转基因   只能识别一种特定的核苷酸序列   不同 

（2）个体生物学 

（3）进行基因治疗、研究基因功能、构建疾病治疗动物模型等

下面这道题题可以很好地理解基因编辑技术的工作原理：

5．（2021海南卷）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。

回答下列问题。

(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是__________。

(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是__________ 。

(3)过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是__________。随后，Cas9蛋白可切割__________序列。

(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是__________，基因敲除成功的判断依据是__________。

(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：__________。

5.【答案】(1)DNA连接酶

(2)感受态细胞法/Ca²⁺处理法

(3) 碱基互补配对     目标（目的）DNA（基因）

(4)DNA分子杂交技术     经编辑过的DNA片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功

(5)表达Cas9蛋白和sgRNA，两者形成复合体；sgRNA识别并结合目标DNA序列；引导Cas9蛋白切割目标DNA序列

6.CENH3基因参与着丝粒复合蛋白的募集和稳定，在着丝粒的组装及染色体的正常分离与传递中起着关键作用，近年来利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对CENH3基因改造以建立单倍体诱导系是研究的热点。科研人员将含有基因编辑系统的Ti质粒导入到甜菜细胞内，制备了CENH3基因序列改变的甜菜突变体。实验时所用载体的T-DNA结构如图1所示。回答下列问题：

(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统由Cas9蛋白和sgRNA组成，作用时sgRNA与靶标DNA单链进行碱基互补配对以确定编辑区间，然后Cas9蛋白能催化__________键水解，其本身对DNA的切割______(填“具有”或“不具有”)类似于限制酶的“限制性”。同时设计两个sgRNA,引导Cas9蛋白在两个位点同时切割DNA,推测构建双sgRNA的意义是_____________________

6.【答案】(1)磷酸二酯不具有  通过双靶点协同作用实现更高效率、更精准的基因编辑效果(或答降低脱靶效应;提高编辑的成功率，合理即可给分)

北京专题

1.（25顺义一模）（11分）学习以下材料，回答（1）~（4）题。

基因编辑技术的变革

CRISPR/Cas9系统是基因编辑技术的常用工具，由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。gRNA嵌入Cas9的RNA结合区，形成稳定的RNA-蛋白复合体。gRNA可识别目标序列，引导Cas9切断DNA双链。这种情况下，细胞内原有的负责修复DNA切口的酶将“行动”起来，修复断裂的DNA（如图示）。

肝脏合成的蛋白T发生错误折叠后，会聚集在心脏、神经等组织引发疾病。科学家研发了基于CRISPR/Cas9技术的基因治疗产品，命名为N-2001。该产品包含靶向T基因的gRNA和编码Cas9的mRNA，并由亲肝性脂质体包裹，注射到患者体内，取得一定治疗效果。但gRNA识别的序列短小，可能结合基因组中与目标序列相似的非目标序列，造成脱靶。

Cas9的两个结构域分别负责切割DNA双链中的一条，其中一个结构域失活得到nCas9，只能切割DNA中与gRNA结合的那条链。利用nCas9 在目标序列的两条链上产生邻近切口，造成双链断裂，能有效减少脱靶效应。但Cas9和nCas9均是对DNA序列的直接改变，一旦发生错误难以纠正。

若使Cas9的两个结构域同时失活，则获得dCas9。dCas9虽然失去了切割DNA的能力，但仍可在gRNA的引导下定位到特定DNA序列上。以此为基础，我国科研人员通过改造获得“dCas9-Tet1”融合蛋白，将Tet1（去甲基化因子）精确地定位到抑癌基因的启动子区域，激活抑癌基因表达。研究表明，该疗法治疗的肺癌模型小鼠，抑癌基因的表达量显著升高，癌细胞增殖迁移能力均明显降低。dCas9基因编辑技术通过改变特定位点的DNA甲基化修饰，调控基因表达，为相关疾病的治疗提供了新思路。

（1）以含Cas9基因的重组质粒为模板，通过_________技术扩增得到含Cas9基因的线性DNA片段，在体外转录出Cas9 mRNA。

（2）由文中信息可知，N-2001输入到患者体内后，在无外源模板的情况下，其发挥作用的过程是：脂质体进入肝细胞后降解并释放Cas9 mRNA→_________→_________→T基因被Cas9剪切发生_______→T蛋白含量降低。

（3）切割DNA双链时，nCas9比Cas9脱靶概率低的原因是_________。

（4）DNMT是一种作用于基因启动子区域的DNA甲基化酶，通过研究确定了编码DNMT催化结构域的基因序列。请在N-2001基础上，设计一种基因编辑疗法的产品，实现对肝细胞内T基因表达的抑制。

1.（25顺义一模）.（11分）

（1）PCR （2分）  

（2）合成Cas9蛋白（2分）   gRNA引导Cas9定位到T基因 （1分）   突变（1分）  

（3）nCas9切割双链产生邻近切口，需两种gRNA分别识别目标基因两条链的两段序列（2分）

（4）靶向T基因启动子的gRNA+编码dCas9-DNMT融合蛋白的mRNA+亲肝性脂质体（3分）

2、（2025北京朝阳二模）斑翅果蝇是农业害虫。我国研究者利用基因编辑技术培育带有雌性不育基因的斑翅果蝇，若将其释放到野外可降低野生斑翅果蝇种群数量。

(1)CRISPR/Cas9基因编辑系统中的gRNA与靶基因特异性结合，引导Cas9酶切断靶基因。断裂的DNA可能发生非同源末端连接修复，导致靶基因中发生碱基的__________，引起基因突变；也可能发生同源重组修复，导致靶基因被供体DNA中的片段替换（图1）。

(2)果蝇2号染色体上T基因控制合成一种信号物质，该物质由神经细胞分泌，是雌蝇产卵的必需信号，对雄蝇育性无影响。研究者制备图2所示供体DNA，将其与靶向T基因的gRNA和Cas9酶共同注入果蝇受精卵。继续培养后在低倍镜下挑选出__________的成蝇，即为成功实现驱动片段替换的个体——G₀。

(3)理论上，当细胞中1个T基因被驱动片段替换后，会表达靶向T基因的gRNA和Cas9酶，同时作为同源重组修复的模板，导致__________，使雌蝇不育。用G₀雄蝇与野生型雌蝇杂交，F₁雌蝇育性情况为__________。

(4)有的G₀果蝇受精卵中T基因发生末端连接修复，突变为t基因。t基因既不能正常表达，也不能被gRNA识别。用携带t基因的G₀雄蝇与野生型雌蝇杂交，F₁自由交配，若整个过程中没有t基因的新发产生，F₂雌蝇中可育个体占比为__________，可见t基因对驱动片段在种群中的传播有抵抗作用。

(5)研究者对驱动片段进行改造，将其中编码gRNA的基因增加为3个，分别靶向T基因中不同的位点。请评价改造后的驱动片段的优点__________。

2.【答案】(1)增添、缺失或替换   (2)发出红色荧光

(3)  另1个T基因也被驱动片段替换     均不育

(4)3/8

(5)T基因中即使发生末端连接修复，也可以被其它gRNA识别，引发同源重组修复，降低t基因产生概率

3.（2021西城期末）19．（12分）阅读以下材料，回答（1）~（5）。

基因魔剪：CRISPR/Cas系统

要揭示生命的运作原理，常需要对基因进行编辑。在过去，这一步异常艰难。但随着CRISPR/Cas技术的出现，科学家已能在极短时间内就更改生命密码。

CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白和人工设计的gRNA构成。在gRNA引导下，Cas9与靶序列结合并将DNA双链切断。随后细胞通过自身的DNA损伤修复机制，将断裂上下游两端的序列连接起来，但通常会在断裂处造成少量核苷酸的插入或缺失。当DNA双链断裂后，如果细胞中有DNA修复模板（由需要插入的目的基因和靶序列上下游的同源序列组成），断裂部分可依据修复模板进行精确修复，从而将目的基因插入到指定位点。

通过在Cas9基因中引入突变，获得了只有切割一条链活性的nCas9。将nCas9与胞嘧啶脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶融合，科学家开发出了单碱基编辑技术（图2），能够对靶位点进行精准的碱基编辑，最终可以分别实现C→T（G→A）或A→G（T→C）的碱基替换。

对CRISPR/Cas系统的不断改造，使其在基因编辑外，还可用于激活或抑制基因的转录等。虽然目前CRISPR/Cas技术还存在一些不足，如脱靶问题等，但作为一种革命性的技术，其应用前景广阔。

（1）利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，需构建含gRNA基因和Cas基因的________，并导入受体细胞。gRNA依据________原则与靶序列特异性结合，引导Cas9蛋白进行切割。

（2）有些遗传病是由于基因中一个碱基对的改变引起的，如果要修正此基因突变，图示的三种途径中，哪种更为合适？请判断并说明理由。

（3）如果要利用CRISPR/Cas9技术将-一个基因从基因组序列中删除，设计gRNA的思路是_________。

（4）将CRISPR/Cas9技术用于抑制基因转录时（不改变基因结构），需对CRISPR/Cas9系统进行改造和设计，请写出基本思路。

（5）将CRISPR/Cas技术应用于人类基因的编辑时，特别要注意________方面的问题。

3.（12 分，每空 2 分）

（1）表达载体/重组 DNA   碱基互补配对

（2）③（或②），能够对突变基因进行精确编辑

（3）设计两个gRNA，使之分别与靶基因的上下游序列互补

（4）在Cas9 基因中引入突变使 Cas9 失去剪切DNA 的功能，人工设计gRNA 使之与靶基因的启动子区域序列互补

（5）安全性和伦理

4.（2023西城期末）20. CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术，科研人员对其进行了一系列改造。

（1）Cas9蛋白能与人工设计sgRNA形成复合体（如图1）。复合体中的sgRNA与目的基因按照________原则特异性结合。复合体在sgRNA引导下结合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成双链断裂，细胞在修复断裂的DNA时会随机插入、删除或替换部分碱基对，从而引发________。

（2）将编码Cas9蛋白的基因改造后形成新基因dCas9，与Cas9蛋白相比，dCas9蛋白失去剪切活性，但与sgRNA结合等功能不变。构建能够表达dCas9的质粒A，设计一系列与红色荧光蛋白基因（RFP基因）上游不同部位结合的sgRNA序列（如图2），并以此为依据构建能表达sgRNA的质粒B，将质粒A、B共同导入含有RFP基因的大肠杆菌，测定大肠杆菌红色荧光强度，实验结果如图3所示。

实验结果显示，对照组的红色荧光强度约为sgRNA3组的________倍。由实验结果可以得出：________。

（3）VP64蛋白可结合RNA聚合酶，激活基因转录，但VP64蛋白无法识别或结合特定的DNA片段。科研人员欲利用上述系统和VP64蛋白促进特定基因表达，请设计促进细胞中已存在的基因X表达的方案_______。

（4）请写出CRISPR/Cas9及其改造产品的在科学研究中的应用_______。

4.（1）碱基互补配对 

基因突变 

（2）100   dCas9 能抑制基因表达，sgRNA 的结合位置距 RNA 聚合酶结合位点越近，对 

基因表达的抑制作用越强。 

（3）根据 X 基因的 RNA 聚合酶结合位点上游序列设计 sgRNA，合成相应基因并构建基因 

表达载体；构建 dCas9-VP64 的融合蛋白表达载体；将上述表达载体导入受体细胞 

（4）定点诱变某基因或促进、抑制某基因表达，通过性状改变研究该基因的功能。

5.（2024海淀期末）20.(12 分)

为提高基因编辑的精准性，减少脱靶，科研人员尝试对基因编辑系统进行改造。 

(1)CRISPR-Cas9是被普遍应用的基因编辑系统，由人工设计的SgRNA靶向目标基因，Cas9蛋白在sgRNA引导下切割目标基因的双链DNA，使其断裂，促使细胞启动自然的DNA修复过程，断口处可能产生碱基错配，从而使目标基因产生突变或缺失等。Cas9蛋白与sgRNA所形成的复合物的功能与基因操作工具中____________的功能类似，但长期存在于细胞核中的Cas9蛋白也可能产生对非目标DNA的切割，从而造成脱靶。

(2)热纤梭菌中Co和Do蛋白能以高亲和力相互作用，形成复合物。科研人员将Cas9 蛋白的N端和C端两个片段分别与Co和Do蛋白融合，构建Cas9(N)-Co复合物和Cas9(C)-Do复合物，这两个复合物在细胞中相遇时，Cas9可恢复全酶活性。科研人员构建图1所示的表达载体，导入受体细胞。

注:核定位序列和核外运序列分别引导蛋白质定位于细胞核和细胞质。

图1

启动子1为远红光诱导型启动子，启动子2持续表达启动子。据此分析，在没有远红光照射时，受体细胞中Cas9(N)、Cas9(C)和Cas9蛋白的存在状态及位置是_______________________________________________。与持续表达Cas9 全酶相比，上述方法的优势是______________________________________________________。 

(3)为检测上述基因编辑系统治疗肿瘤的效果 ，科研人员在小鼠皮下移植肿瘤制作荷瘤小鼠。将构建好的上述载体注射到荷瘤小鼠的肿瘤部位，实验组一段时间内定期用远红光照射荷瘤小鼠。

图2

 ①检测本系统对目标基因PLK(一种肿瘤标志基因，可促进细胞分裂)的编辑效果。实验过程如下:提取不同组别小鼠肿瘤细胞的DNA, PCR扩增PLK基因片段，所得PCR产物热变性后降温复性。用T酶(可识别含错配碱基的DNA并在错配处切割)酶切复性后的PCR产物，电泳检测结果如图2所示。据图2核酸电泳分离的DNA分子大小可知此系统对目标基因进行了编辑，理由是_________________________________________。

②实验组小鼠的肿瘤明显小于对照组，分析原因是_________________________________________。 

(4)科研人员希望利用本编辑系统对多个基因在不同时间进行可控编辑，思路是_________________________。

5.（12分）

（1）限制酶     

（2）无 Cas9（N）、Cas9（C）存在于细胞质、无 Cas9    

仅在远红光诱导时才有全酶进入细胞核，减少Cas9全酶长时间在细胞核中对非目标DNA的切割

（3）①与黑暗组相比，远红光组增加了两条更小的条带，说明PCR产物被酶切

②远红光诱导使Cas9恢复全酶活性，PLK基因产生突变，抑制肿瘤细胞的增殖  

（4）构建多个不同表达载体3导入细胞，不同的表达载体3含不同的sgRNA基因与不同的诱导型启动子

6.（2022东城期末）17．（12分）

为更好的利用农杆菌转化玉米，科学家将基因编辑系统引入农杆菌Ti质粒对其进行改造。

（1）Ti质粒在基因工程中常作为_________。改造后的Ti质粒的部分序列如图1所示，转入玉米细胞后，gRNA能够与玉米细胞DNA特定位点结合，从而引导Cas9蛋白在此位点切断_________键断开DNA．HR1和HR2与玉米DNA切断位点上下游序列同源，玉米细胞能以同源序列之间的序列为模板合成一段DNA，连接断开的DNA分子，实现外源片段插入。图1中插入玉米染色体的片段能稳定表达和扩增，其他区域的基因只能瞬时表达且无法扩增。在转化玉米的过程中，使用改造后的Tⅰ质粒的优点是_________。

注：HRA为抗除草剂基因：NPTⅡ为卡那霉素抗性基因

（2）用上述改造后的农杆菌转化玉米幼胚，在培养基中加入除草剂或_________均能筛选出已发生转化的幼胚。对培养后的植株进行PCR（引物设计如图2），部分植株实验结果如图3。

电泳结果显示_________号玉米中成功插入了外源基因，自交后_________（选填“会”或“不会”）发生性状分离。

（3）标记基因插入转基因作物染色体中往往会影响植物的生长发育，并带来环境安全隐患。现要制备转耐寒CXE-20基因的转基因玉米，请利用该方法设计Ti质粒相关序列，选择相关基因的序号填入Ti质粒部分序列示意图。

①Cas9  ②gRNA  ③HRA  ④NPTⅡ  ⑤CXE-20  ⑥HR1  ⑦HR2

6.（12分）（1）载体  磷酸二酯  能够在特定位点插入基因片段

（2）卡那霉素  1、6、7、9、10、11  会

（3）

7、（2025北京东城二模）CRISPR-Cas9基因编辑技术与AAV病毒结合使用是目的基因靶向敲入的有效途径。

(1)gRNA和Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统的关键组成，如图1，gRNA根据__________ 原则与靶序列特异性结合后，实现Cas9的定点切割。AAV是DNA病毒，在基因工程中作为__________将目的基因导入受体细胞，其两端的ITR序列相同，是病毒复制和包装必需的。Cas9切割靶序列后，AAV基因组提供DNA修复的模板，从而实现目的基因的敲入。

(2)将图1中的CRISPR-Cas9相关DNA片段和AAV基因组导入人多能干细胞，一段时间后，分别提取DNA，同时加入图1所示的引物1、2、3进行扩增，结果如图2。

引物1和2扩增后检测到条带说明__________。根据图2结果推测，同源染色体中只有一条染色体敲入了目的基因的组别是__________。

(3)用图1中引物1和4对（2）提取的DNA进行扩增，结果如图3。为解释图3结果，研究人员检测了细胞中敲入目的基因的拷贝数，结果如图4。

①图4中的B组结果对应图3中的__________组。

②在图4中找到S4组的对应结果，并据此解释图3中S4组无条带的原因__________。

(4)进一步研究发现，在某些组别中出现多个AAV基因组DNA通过ITR序列连续串联插入，这类细胞的比例高达39%。请对CRISPR-Cas9相关DNA片段进行改进，以降低AAV基因组DNA串联插入细胞的比例，方案是        。

7.(1)  碱基互补配对      载体

(2)  目的基因成功敲入      S2、S3、S4、S5

(3)  S1     S4组对应图4中的E组，细胞中一对同源染色体的两条染色体均敲入了不止1个目的基因，导致引物之间距离过大而无法完成PCR

(4)增加一个靶向ITR的 gRNA 基因

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