质粒图谱里箭头一会正向一会反向是啥意思？

 

来源公众号：老熊精读医学生物文献

对于刚开始接触载体构建的小伙伴来说，对着软件里的质粒图谱，会被那些密密麻麻的箭头搞晕。为什么这些箭头有的顺时针指，有的逆时针指？今天熊叔就来和大家聊一聊这些箭头到底在指什么？

01 箭头到底代表什么？

我们知道，基因的表达要经过转录即以DNA为模板合成RNA。这个合成过程具有明确的方向性，总是从5’端到3’端。而图谱上的每一个箭头，代表的是一个开放阅读框ORF或一段具有特定功能的序列比如启动子。所以箭头的方向，指的就是该基因的转录方向，也就是 RNA 聚合酶工作的方向。箭头尾巴的往往是启动子所在的位置，箭头头部则是终止子所在的方向。

02 为什么箭头一会正向一会反向？

这就得回到质粒最根本的结构：环状双链DNA。质粒图谱都画成一个圆圈，包含两条链：一条我们常称为正链，另一条是负链。两条链反向平行。对于环状质粒来说，这两条链自然也就是两个方向相反的环。基因可以坐落在其中任意一条链上。因为它坐落的链不同，它的转录方向也就跟着相反。比如我们看pBR322这个质粒，图谱上氨苄抗性基因（amp）是逆时针画的，而四环素抗性基因（Tet）是顺时针画的。

图片引自 microbenotes.com

为什么会这样？因为这两个基因就分别坐落在质粒的两条不同链上。AmpR利用的模板链是环中的某一条，而TetR利用的恰恰是互补的那条。方向不同，对他们各自的表达毫无影响。很多其他质粒比如pUC系列、pET系列里，抗性基因和多克隆位点附近的筛选标记也常常方向各异，道理亦相同。

那么有的同学就要问了：为什么不能所有箭头都朝一个方向？全都正向，或者全都反向，整整齐齐不好吗？

先回答“能不能”。能。这在技术上毫无难度。那为什么不这么做呢？一是基因本来在哪条链上；二是没有必要。

① 历史遗留问题：自然重组与进化保留

实验室常用的质粒骨架多源于自然界中细菌的天然质粒。在进化过程中，质粒通过转座子或基因水平转移整合了多种抗性基因或功能片段。DNA片段的重组插入往往不具备严格的方向特异性。只要插入的基因连同其自身的启动子结构完整，无论其处于双链DNA的哪一条链，都能被宿主细胞的RNA聚合酶识别并正常转录。所以后来实验室提取和改造这些天然质粒构建商品化载体时，直接保留了这些功能元件原始的空间朝向。

② 避免转录干扰

在构建复杂质粒时，如果将多个强启动子驱动的基因全部同向排列在同一条DNA链上，容易引发转录干扰。一个是通读现象Read-through，即当上游基因的转录活性很高时，RNA聚合酶可能会越过转录终止子，继续向下游序列转录；其次是空间抑制问题，RNA聚合酶的通读活动会改变下游DNA的超螺旋结构，并产生空间位阻，阻碍下游基因启动子与转录因子的结合，最终导致下游基因表达受抑制。

为了避免这种情况，分子生物学设计或自然选择常将独立的表达框分布在两条互补链上比如背向转录。这样不仅能利用反向平行的双链各自作为模板，还能隔离转录复合物，保证各个基因独立、高效地表达。

③ 提高遗传信息的空间利用率

DNA的双链结构允许在同一段碱基序列上储存多重信息。在慢病毒、腺相关病毒等病毒载体或某些精简的天然质粒中，由于具有严格的包装容量限制，正链和负链常被同时利用。

03 读懂箭头对你做实验很重要

理解了箭头方向的意义，你在设计克隆时就能少走很多弯路。因为有一些特殊情况下，箭头方向是有意为之的：

① 双向启动子：有些质粒带有双向启动子，特点是夹在两个基因中间，并且这两个基因是背向排列的，即一个在顶链往右转录，一个在底链往左转录。内部通常包含一个共用的增强子Enhancer或转录因子结合位点，核心区域两侧各有一个短启动子分别指向两边。

比如说这个pBI‑CMV1 是哺乳动物双向表达载体，可实现两种目的蛋白的组成型表达。两个目的基因需分别克隆至两组相互独立的多克隆位点（MCS1、MCS2），且各自自带起始密码子与终止密码子。蛋白表达由两个人巨细胞病毒组成型启动子驱动：MCS1 上游为 CMV IE 启动子，MCS2 上游为截短型 minCMV 启动子。

②复制起点ori：虽然ori本身并不是编码蛋白的基因，但有时也会画一个箭头来表示复制起始及复制叉前进的方向。对初学者来说，只需知道这个箭头并不是基因转录方向就好，不必和抗性基因的箭头混为一谈。

所以当你把目的基因连入质粒时，必须让它的编码区方向与启动子箭头方向一致，否则转录出来的RNA就是反义的，翻译不出想要的蛋白。

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