微生物学研究中细菌计数法你都知道哪些？

 

来源公众号：生物清风岭 作者：莒地莒人

菌体浓度是微生物学中的一个重要指标，它指的是单位体积培养液中菌体的含量。准确测定菌体浓度对于微生物学研究和实验至关重要。

1. 直接计数法

直接计数法通过显微镜直接观察细菌悬液中的细菌数量，并计算相应的浓度。

1.1 细菌计数板法

细菌计数板法是一种传统的直接计数方法，它使用一种特制的玻璃板，上面有精确的刻度和容积，用于容纳和计数细菌悬液中的细菌。

操作步骤：

◆制备细菌悬液。

◆将样品细菌悬液置于细菌计数板的计数池内。

◆使用显微镜观察计数室内的细菌。

◆根据计数室刻度内的细菌数计算样品中的含菌数。

特点：

★设备简单，结果较准确，可快速得到结果。

★能观察微生物形态特征，但不能区分活菌和死菌。

1.2 电子计数器计数法

电子计数器计数法是一种现代化的直接计数方法，其工作原理类似于血细胞分析仪。

操作步骤：

◆制备细菌悬液，确保不含碎片。

◆电子计数器测定小孔中液体的电阻变化。

◆当细菌通过小孔时，电阻增加形成脉冲，自动记录。

特点：

★结果较准确，但只能识别颗粒大小，不能区分是否为细菌。

直接计数法，包括细菌计数板法和电子计数器计数法，是微生物学研究中常用的细菌浓度与数量测定方法。这些方法能够提供快速、准确的细菌计数结果，尽管它们在区分活菌和死菌方面存在局限性。

2. 活菌计数法（间接计数法）

活菌计数法基于活细菌在适宜条件下能形成菌落的原理。这种方法通过将待测样品进行一系列稀释，然后将稀释后的样品接种到培养基上，通过培养后形成的菌落来计数活菌数量。

2.1 稀释平板计数法

稀释平板计数法是活菌计数法中最常见的一种。

操作步骤：

◆将样品进行10倍系列稀释。

◆接种到无菌平皿中，倒入培养基混匀。

◆培养后计数菌落。

◆计算活菌数。

2.2 薄膜过滤计数法

稀释平板计数法是活菌计数法中最常见的一种。

操作步骤：

◆通过微孔薄膜过滤浓缩样品。

◆将滤膜放在固体培养基上培养，长出菌落后计数。

2.3 PMA-qPCR技术

PMA-qPCR技术是一种结合了荧光染料和定量PCR的先进活菌计数方法。

PMA（Propidium Monoazide）是一种能与DNA结合的染料，活细胞不会被PMA标记，而死细胞的DNA会被PMA结合。

操作步骤：

◆PMA处理样品，区分活细胞和死细胞。

◆提取DNA。

◆使用qPCR对DNA进行定量分析。

PMA-qPCR技术在发酵食品活菌计数中的应用日益广泛，它能够提供快速、准确、特异的活菌计数结果。

2.4 MTT比色法

MTT比色法（甲基四唑溴化物比色法）是一种基于活细胞内线粒体脱氢酶活性的活菌计数方法。

操作步骤：

◆加入MTT，活细胞中的线粒体脱氢酶将MTT还原成蓝紫色的蓝紫色甲瓒(Formazan)。

◆测定溶液的吸光度（OD值）。

MTT法快速、经济、操作相对简便、重复性较好，近年来被广泛应用到多种微生物的活菌计数中。

3. 比浊法

比浊法通过比较细菌悬液的浊度来测定菌体浓度。

3.1 麦氏比浊法

麦氏比浊法是一种传统的比浊技术，由McFarland发明，用于微生物悬液的浊度标准比对。该方法优点在于简便快捷，适用于大量细菌悬浮液的快速测定，但对颜色太深的样品不适用。

操作方法：

◆使用不同比例的硫酸和氯化钡生成硫酸钡沉淀，形成标准浊度管。

◆无菌操作将被测定的肉汤培养物加到与标准管相同直径的无菌试管中。

◆以无菌操作向被测定试管加入无菌生理盐水，直到浓度与所要求的标准管的浓度相同。

3.2 光电比浊法

光电比浊法是一种基于光散射原理的现代比浊技术。其优点在于简便、迅速，可以节省许多稀释平板计数法的时间，便于在生产实践中控制细胞的数目。

基本原理：

★细菌悬液的浓度与光密度成正比，与透光度成反比。

★使用分光光度计测定光密度（OD值）。

操作步骤：

◆制作标准曲线：应尽量控制光密度值在0.1—0.65之间，以得到较高精确度。

◆测定待测菌悬液的光密度值，根据标准曲线查得每毫升的细菌数。

4. 测定重量法

重量法是测定细菌浓度的经典方法，它包括干重法和湿重法两种主要形式。此方法适用于菌体浓度较高的样品，是测定丝状真菌生长量的常用方法。

4.1 湿重法

湿重法是通过测量单位体积培养物经离心后湿菌体的重量来确定细菌浓度的方法。

操作步骤：

◆取一定体积的细菌培养液，并使用离心机分离细菌。

◆称重湿菌体，计算细菌浓度。

4.2 干重法

干重法是通过测量单位体积培养物经离心后，将湿菌体烘干至恒重后失去水分的重量来确定细菌浓度的方法。

干重法的优点是结果较为准确，因为它排除了培养液中水分和其他可溶性物质的影响，但操作时间较长，需要等待菌体完全干燥。

操作步骤：

◆取一定体积的细菌培养液，并使用离心机分离细菌。

◆烘干菌体，称重，计算细菌浓度。

5. 颜色改变单位法（CCU法）

CCU法基于微生物在培养基中的代谢活力来计数微生物数量。此方法特别适用于那些用传统比浊法无法计数的微生物，例如支原体。

CCU法在微生物学研究中有着广泛的应用，尤其是在那些需要精确测定微生物代谢活力的场合。

操作步骤：

◆准备培养基，进行样品稀释。

◆观察培养基颜色的改变，确定CCU。

特点

★CCU法灵敏度高，适用于那些难以通过传统方法计数的微生物。

★CCU法计数的是微生物的相对含量，而不是绝对数量。

★该方法操作简单，但需要精确的操作技巧以避免污染。

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