基因工程的关键——重组克隆载体和表达载体的构建过程和原理诠释

 

来源公众号：学甫无境 作者：王甫荣 

问题的提出：2024年多地高考试题中出现了重组表达载体，可以参考文章末的链接，那么，重组表达载体是如何构建的？原理分别是什么？

构建重组载体是基因工程中的关键，重组载体的构建是分子生物学中的一项重要技术，它涉及到将外源基因插入到一个能够复制和表达的载体中，以便在宿主细胞中进行基因的表达和功能研究。高中生物学教材中出现的重组表达载体的构建是常规的方法，在现代分子生物学中该过程还要全面，现整理如下：

第一步：引物的设计

两个引物的5′端还需要各加上一个限制酶的识别位点及其保护碱基（前者高考试题出现过，后者还未出现过），以利于限制酶稳定结合到DNA双链并发挥切割作用，而所选择的限制酶必须与载体上位点相匹配。

添加保护碱基时，最关心的是保护碱基的数目，而不是种类。不同的酶切位点需要不同数量的保护碱基。一般情况下，普通的限制酶只需加入2到3个保护碱基即可，但有些酶如NdeI需要至少六个保护碱基，碱基一般为G或C。

保护碱基的作用包括‌：‌提高酶切效率，在分子克隆实验中，保护碱基可以提高酶切位点的稳定性，使其更容易被限制性核酸内切酶识别和切割；‌避免相邻酶切位点的干扰‌，相邻的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少会影响旁边的酶切位点；‌增加PCR扩增效率‌，保护碱基可以帮助引物更好地结合到模板DNA上，从而提高PCR扩增效率。

第二步：PCR扩增目的片段

引物合成后，选择合适的DNA聚合酶和模板DNA，用PCR扩增目的片段。通过琼脂糖凝胶电泳检测目标条带是否符合预期，如果条带单一，只需要将PCR产物通过硅胶纯化就可以了；若条带不单一，还需要在电泳后，在紫外灯下对目标条带进行割胶回收，溶胶后同样用硅胶膜纯化柱纯化。

硅胶纯化的原理：基于物质在硅胶上的吸附和解吸附能力的不同来实现分离纯化的。硅胶是一种多孔性、具有吸附能力的颗粒状无机物质，能够吸附有机物、无机物、蛋白质等。其分离过程主要包括两个步骤：样品的进样和洗脱。‌

第三步：对目的基因和质粒载体进行双酶切

用相同的限制酶在适当温度下分别双酶切目的基因片段和载体DNA。根据所加DNA分子，确定酶切10min至数小时，保证酶切完全。

双酶切优点主要是防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化；避免目的基因反向连接的情况。

第四步：T4DNA连接酶将酶切后的目的基因和质粒载体连接成一个整体

T4DNA连接酶进行连接反应，T4DNA连接酶是从T4噬菌体中分离得到的，既可以连接两个互补的黏性末端，也可以连接两个平末端。

根据插入目的片段与载体各自的DNA浓度及片段长度的不同，一次连接反应需要投入的插入片段与载体DNA总量的摩尔比应控制在10：1左右较有利于连接反应的进行。连接温度为22℃时，T4DNA连接酶的活性较高，1－2h即可完成连接，但酶较易失活；在4℃或16℃连接时，酶的活性维持时间较长，连接后更稳定，但通常需要反应8h以上。

近几年，一种被称为恒温一步法不依赖T4DNA连接酶的克隆技术已得到广泛应用。首先将载体线性化，通过引物设计在插入片段两端引入线性化载体的末端序列，PCR扩增插入片段后，其两端具有线性化载体末端相同的序列。然后，按一定比例加入插入片段和线性化载体，再加入dNTP，在T5外切核酸酶（一种沿5’→3’方向降解DNA的核酸外切酶）、DNA聚合酶和TaqDNA连接酶的混合催化下，50℃恒温反应15－30min即可完成反应。

第五步：细菌转化以获得重组载体的数量

由于连接成功的重组载体数量有限，远远不能满足实验需求，有必要通过细菌转化以获得重组载体的数量。大肠杆菌在低温、低浓度的CaCl₂溶液中处理后成为感受态，细胞膨胀，细胞膜通透性发生改变，易于吸附外源DNA。将连接产物与感受态细胞在试管中混匀，于冰上静置30min，然后转移到42℃热刺激30－90s，此时连接产物就可能被感受态细胞吸收。再将其置于37℃摇床复苏约1h，然后均匀地涂布在含有抗生素的培养基上，37℃培养箱倒置培养。因为重组载体的质粒上带有抗性基因，从而使重组大肠杆菌细胞能够在培养基中存活下来。

CaCl₂溶液中处理和热刺激的原理：以大肠杆菌为例，大肠杆菌在0℃的氯化钙低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

第六步：菌体内提取纯化质粒DNA

过夜培养后，培养基应该长出很多菌落，随机挑取部分菌落，用菌内的重组质粒做DNA模板，进行菌落PCR扩增，鉴定目的基因片段是否插入载体中，挑取阳性菌落于液体培养基中37℃培养10－13h。

在强碱性溶液中裂解菌体，释放质粒DNA，然后用酸中和反应，离心收集上清液后，通过硅胶膜纯化柱纯化出质粒DNA。通过PCR、限制性酶切分析和测序等方法验证目标基因是否正确插入载体。

第七步：连接到表达载体

最后一步是将目的基因从克隆载体上PCR下来，连接到表达载体上，在克隆载体的基础上增加了控制基因表达的元件，如启动子、终止子、核糖体结合位点等。这些元件共同协作，确保外源基因在宿主细胞中的高效表达。如果载体含有诱导型的启动子，可以通过添加诱导剂来控制基因的表达。表达载体的种类很多，取决于你想转化的宿主细胞类型，有真核的、原核的、植物的、酵母的等。根据实验结果，可能需要对载体进行进一步的优化和调整，以提高表达效率或改善基因的功能。

总之，重组表达载体的构建是一个复杂的过程，需要精确的实验设计和严格的操作。随着分子生物学技术的发展，构建重组表达载体的方法也在不断进步，为基因研究和应用提供了强大的工具。

试题：研究人员利用一种从某生物体内分离出的抗盐碱基因，通过基因工程、植物细胞工程等现代生物技术，培育出了抗盐碱大豆，使大豆能在盐碱地中正常生长，提高了大豆的产量。下图为培育流程，其中①~⑥为不同过程，其中Amp^R为氨苄青霉素抗性基因，AluⅠ、SmaⅠ、HindⅢ和PstⅠ为限制酶。根据所学知识，回答下列问题：

（1）不用限制酶AluⅠ切割抗盐碱基因的原因是__________。用限制酶切割抗盐碱基因和质粒时，选择SmaⅠ和PstⅠ比只选择PstⅠ的优点是 __________（答出两点）。（答案：AluⅠ切割会破坏抗盐碱基因     防止目的基因和质粒反向连接；防止目的基因和质粒自身环化）

（2）研究人员用AluⅠ切割原质粒得到7.7kb的DNA片段，切割重组质粒得到3.0kb、4.8kb的DNA片段；SmaⅠ和PstⅠ切割原质粒得到2.3kb、5.4kb的DNA片段（注意：DNA片段大小与图中所画比例一致），则抗盐碱基因的长度为 __________。（答案：2.4kb）

（3）利用PCR技术可获取大量目的基因，PCR反应体系中有两种引物，在复性时引物会结合到互补DNA链上，对两种引物的设计要求之一是__________；除引物外，PCR反应体系中还需要加入__________（答出两点）。（答案：两种引物之间不能碱基配对     模板、dNTP、TaqDNA聚合酶、PCR缓冲液）

（4）将目的基因导入植物细胞时，常采用农杆菌转化法，将目的基因插入Ti质粒中。利用Ti质粒，通过农杆菌转化法可将抗盐碱基因导入大豆愈伤组织细胞的理论依据是__________。（答案：农杆菌中Ti质粒上的T－DNA能转移并整合到植物细胞染色体上）

（5）为了筛选出成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基中需要加入的物质是 __________。诱导组织细胞脱分化的是__________号培养基。图中④⑤⑥过程，所利用的生物技术的理论基础是__________。（答案：氨苄青霉素  3     植物细胞全能性）

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