关于mRNA疫苗研发的解读

 

作者：和渊 等（中国人民大学附属中学）

2023 年的诺贝尔生理学或医学奖颁发给了mRNA 疫苗研发团队卡塔琳·考里科（KatalinKarikó）和德鲁·魏斯曼（Drew Weissman），理由是“他们在核苷碱基修饰方面的发现，这些发现使得针对COVID-19（新型冠状病毒）感染的有效mRNA疫苗得以开发”。卡塔琳·考里科和德鲁·魏斯曼将体外合成的mRNA中的假尿苷替换为尿苷注射到机体后，不仅可以减少机体自身的免疫反应，而且还能极大增加mRNA的翻译效率。本文简单介绍mRNA疫苗的研发流程。

1 疫苗的作用和类型

疫苗是指用各类病原微生物制作的用于预防接种的生物制品，即把减活或者灭活的病原体（或者活性成分）注射到身体内，使自身产生对抗病原体的能力。常用的新型冠状病毒（以下简称新冠病毒）感染疫苗主要包括灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗和mRNA疫苗等。

灭活疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗等是最常见的疫苗，其研发过程比较复杂，需要不断地培育、挑选、处理，在制作完成之后还要经过动物实验和人体临床试验，确认安全且有效之后才能批准入市，这一整个过程可能需要10 年之久，长周期的疫苗研发流程对于亟需防治的新冠病毒感染过于漫长。

mRNA疫苗的设计和生产比传统疫苗的研发周期要缩短很多。一旦已知了目标病原体的遗传信息，就可以相对迅速地开始生产疫苗，而无须像传统方式一样培养和处理活病毒或蛋白质抗原。且由于不需要使用活病毒，减少了疫苗生产过程中的生物感染风险。由此可见，mRNA疫苗是一种比较理想的疫苗类型。

2 mRNA疫苗的研制思路

利用mRNA研制疫苗的思路是：确定病原体关键蛋白（如新冠病毒刺突蛋白），以此为依据推测其编码基因的序列并体外合成关键蛋白的mRNA，把合成的mRNA注入人体，让mRNA指导人体细胞合成刺突蛋白，并引发人体的免疫应答。

2.1 确定病原体关键蛋白，并以此为依据推测其编码基因的序列 通过生物信息学比较不同物种或毒株的病原体，找出高度保守的蛋白质或序列；或者通过免疫筛查找出诱导强烈免疫应答的病原体蛋白质；通过共沉淀、酵母双杂交、亲和纯化等经典的生化实验操作，找出在感染过程中起关键作用的病原体蛋白。找出病原体侵染的关键蛋白（抗原决定簇）后，通过乙酸纤维电泳、质谱法、核磁共振法等对蛋白质进行鉴定，确定其氨基酸序列。然后，使用Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）在 GenBank或其他相关的生物信息学数据库中对蛋白质序列进行搜索，找出与蛋白质序列高度相似的已知序列，从而推测这些序列对应的病毒基因序列。

2.2 体外合成mRNA 体外合成mRNA的技术，通常称为体外转录（in vitro transcription，IVT）。对于RNA病毒，先提取总RNA，逆转录形成DNA，再使用DNA模板生成mRNA，具体流程为：DNA模板准备—转录反应—在mRNA上加帽和加尾—RNA纯化。

1）DNA模板准备。DNA模板通常为线性化的质粒，含有所需的mRNA序列及一个能被RNA聚合酶识别的启动子，通过聚合酶链式反应（PCR）将DNA模板准备好，为下一步的转录反应奠定基础。
2）转录反应。将DNA模板、三磷酸核苷（NTPs）、RNA 聚合酶（如T7、T3或SP6 RNA聚合酶，取决于启动子的类型）、缓冲液及其他必要的因子等混合，利用RNA聚合酶进行体外转录，得到mRNA分子。
3）在mRNA上加帽和加尾。在转录完成后或与转录同时，在反应体系中添加加帽酶（cappingenzyme）和适当的供体分子（如GTP或甲基化的GTP），形成5′端的帽子结构；同时，使用多聚A聚合酶添加poly（A）尾，形成3′端的多聚腺苷酸尾，即可获得成熟的mRNA。
4）RNA纯化。转录后，由于新合成的mRNA含有未掺入的NTPs、DNA模板和其他杂质，需要通过一定手段去除，从而得到纯化的mRNA。

2.3 将外源合成的mRNA注入人体，激发人体免疫应答 外源合成的mRNA被注射到体内后，会通过体液运输，进入巨噬细胞等抗原呈递细胞（APCs）。之后，mRNA在抗原呈递细胞内部表达出相应的病原体蛋白，并呈递到细胞表面，激活辅助性T细胞，进而激活T细胞和B细胞，使得B细胞产生相关抗体，细胞毒性T细胞裂解被抗原侵染的细胞。mRNA疫苗的工作机制如图1所示。

此过程中面临3个重要的科学问题：外源mRNA进入细胞中能否指导蛋白质的翻译？外源mRNA诱发人体先天免疫系统从而导致严重的细胞炎症反应怎么解决？mRNA在运输过程中容易被降解怎么解决？下文分别对这3个问题进行阐述。

2.3.1 外源mRNA进入细胞后能否作为模板指导翻译 经由细胞核转录形成的内源mRNA可以翻译形成蛋白质，外源mRNA进到人体细胞中后，能否指导细胞内形成蛋白质？1990年，威斯康星大学一个研究团队，将mRNA注射到小鼠体内，并检测到了相应的蛋白表达。1992年，另一个研究团队在大鼠中进一步证明，体外注入的mRNA表达出的蛋白质还具有生理活性。这意味着外源合成的mRNA进入细胞后仍旧可以指导细胞合成蛋白质（如刺突蛋白），因此，mRNA可以作为抗原激发人体产生免疫反应，从而起到疫苗的作用。

2.3.2 外源mRNA导致细胞炎症的解决方法 尽管外源mRNA可以指导细胞内蛋白质的形成，但是其本身作为一种外来物质，可以被机体识别，诱发细胞的先天免疫系统活化，从而使外源mRNA降解而无法翻译为抗原蛋白分子，也无法引起有效的免疫保护。如何防止mRNA被人体识别？

考里科和魏斯曼发现，外源RNA会被Tolllike receptor（TLR）识别。而之所以会被识别，是因为外源RNA与哺乳动物内源RNA不同，缺乏某些修饰，这种修饰的区别体现为：哺乳动物中的RNA中具有假尿苷，被称为第5种核苷酸，但体外合成的外源RNA没有假尿苷的修饰。因此，外源RNA由于缺乏假尿苷的修饰会被机体免疫系统识别，从而导致炎症反应。于是，考里科和魏斯曼把外源mRNA上的尿苷替换成了假尿苷，外源mRNA 不再产生严重炎症反应，因此，解决了mRNA在人体内应用的安全性问题。

考里科等还做了后续实验，去除了双链RNA对mRNA进行的纯化，不仅减少了细胞内炎症的发生，而且增加了翻译的效率，提高了mRNA的应用效率。

2.3.3 mRNA在运输过程中容易被降解的解决方法 mRNA非常容易被降解，尚未被运输到相关细胞内作为模板指导翻译形成抗原蛋白分子之前，就有可能被降解。该如何解决？研究人员构建出一个脂质纳米颗粒运载系统LNP（lipid nanoparticles）（图2），修饰后的mRNA由脂质纳米颗粒载体递送到人体细胞中，能避免mRNA被机体分解，并且能够刺激免疫系统产生抗体，中和入侵的病毒，该方法比完全依赖免疫系统本身效果更好。

能沿着肿瘤附近的破碎血管进入细胞，帮助运输癌症药物，但结构简单的普通脂质体为中性或略带负电荷，这使得其很难有效地与带负电的酸性DNA或RNA结合。科学家设想，给脂质体添加带有正电荷的脂质，可以与带有负电荷的核酸形成稳定平衡。使用永久带有正电荷的人造脂质会带来巨大的毒性，因为这些脂质会破坏细胞膜结构。如何解决这个问题？科学家的策略是使用可电离的脂质，让其在特定的条件下（如酸性环境），短暂携带正电荷，这样就能与核酸结合，将RNA包裹在其中，进行投递。

综上所述，考里科和魏斯曼的工作解决了mRNA作为疫苗的稳定性差（稳定性）、体内效率低下（有效性）和激发机体先天免疫系统（安全性）的问题，使人工合成的mRNA能够安全地注射到人类细胞内，为疫苗研发作出了突出贡献。

mRNA新冠病毒疫苗的成功，让科研人员开始寻求包括流感、诺如病毒、疟疾、肺结核、登革热、寨卡病毒、艾滋病等各种疾病的mRNA疗法。同时，mRNA疗法的研究还扩大到了其他领域，例如，治疗一些癌症、食物和环境过敏以及自身免疫病，相信mRNA疫苗和mRNA疗法在未来具有广阔的应用前景。

文章来源：和渊,王一苇,鲁冰,等.关于mRNA疫苗研发的解读[J].生物学通报,2024,59(10):88-91.