单克隆抗体制备的详细过程·全解析

 

来源公众号：地球玩家2号

从一节”教材简略、师生易错”的内容，
到一份让你彻底理清思路的备课指南

📚 选择性必修3   🎯 备课参考

写在前面：“动物细胞融合技术与单克隆抗体”是人教版选择性必修3《生物技术与工程》中的一节重要内容。
教材篇幅有限、流程跳跃，常导致师生在备课、复习中产生诸多疑惑—— “两次筛选到底筛什么？”、 “用的是B细胞还是浆细胞？”、 “HAT培养基为什么能选出杂交瘤？”……
本文结合权威教材、文献与高校免疫学资料，把每一个细节、每一个易错点都讲透。

PART 01
历史回眸：一篇论文与诺贝尔奖

1975年8月7日，《自然》（Nature）杂志刊登了一篇题为 “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity” 的论文。它的两位作者——德国科学家 乔治·克勒 和阿根廷裔英国科学家 塞萨尔·米尔斯坦 ——首次将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞成功融合， 创造出了一种既能无限增殖、又能稳定分泌单一特异性抗体的”杂交瘤细胞”。

这一发现彻底改变了抗体研究和应用的格局。1984年，他们与免疫学家耶尔纳共同荣获 诺贝尔生理学或医学奖。

截至今天，全球已经报道的单克隆抗体超过 10万种， 用于诊断和治疗的单克隆抗体药物超过 500余种， 包括我们熟悉的早孕检测、新冠抗原检测、PD-1/PD-L1肿瘤免疫治疗药物等。

PART 02
概念辨析：什么是”单克隆”抗体？

2.1 一个B细胞 ≠ 一种抗体？

动物在免疫应答过程中，体内可产生百万种以上不同特异性的抗体。 但请记住一个核心规律：

一个B淋巴细胞（活化分化后的浆细胞）只产生一种特异性抗体—— 它只识别抗原上的一种抗原表位。

这意味着：自然抗原往往含有多个表位，传统方法（如反复给动物注射抗原后从血清中纯化抗体）得到的是 多克隆抗体——一群来自不同B细胞、识别不同表位的混合抗体。

2.2 多克隆 vs 单克隆：一表看清

比较项	多克隆抗体	单克隆抗体
来源	多种B细胞克隆	单一B细胞克隆
识别表位	多种抗原表位	仅识别一种特定表位
特异性	较差，易出现交叉反应	极强，几乎不交叉
灵敏度	一般	高
化学性质	不均一	高度均一
产量	低、批次差异大	可大量、稳定生产

PART 03
核心原理：两种细胞的”强强联合”

要生产大量的单一抗体，必须满足两个条件：

• 能分泌特异性抗体——B淋巴细胞具备这一能力，但它在体外不能无限增殖。
• 能在体外大量繁殖——骨髓瘤细胞（一种癌细胞）可以无限增殖，但它不分泌特定抗体。

科学家的奇思妙想是：把这两种细胞融合在一起，让一个细胞同时具备两种”超能力”。 这就是杂交瘤细胞（hybridoma）——它继承了B细胞的抗体合成能力，又获得了骨髓瘤细胞的无限增殖能力。

    图1 杂交瘤细胞同时具备亲本细胞的两大优势

PART 04
详细制备流程：七步到位

下面我们把单克隆抗体的制备过程拆解为7个关键步骤。 建议同学们对照流程图，逐步理解每一步的目的与原理。

图2 单克隆抗体制备的完整流程图

4.1 第一步：抗原免疫小鼠

1、激活机体的体液免疫

选用合适的实验动物（最常用6–8周龄的BALB/c雌性小鼠），按预先设计的免疫方案，将 特定抗原分多次注射到小鼠体内。

抗原经血液或淋巴循环进入外周免疫器官（主要是脾脏）， 刺激相应的B淋巴细胞克隆活化、增殖、分化，从而在体内形成 能产生特异性抗体的B淋巴细胞群。

通常在最后一次加强免疫后第3天取脾，此时浆母细胞数量达到峰值， 融合效率最高。

4.2 第二步：从脾脏中分离B淋巴细胞

2、为什么不取血液而取脾脏？

这是一个经典的高考易考点。脾脏是哺乳动物最大的外周免疫器官， 免疫应答主要发生在脾脏的白髓部分。注射抗原后，脾脏中富集了大量针对该抗原活化的B淋巴细胞， 远比外周血中的浓度高、数量多。

取出小鼠脾脏后，在无菌条件下用研磨方法将其制成脾细胞悬液， 即可作为细胞融合的”亲本细胞之一”。

4.3 第三步：培养骨髓瘤细胞

3、为什么是骨髓瘤细胞？

骨髓瘤细胞是浆细胞起源的恶性肿瘤细胞，与产生抗体的B/浆细胞有”亲缘关系”， 因此融合后能更好地维持抗体合成机制。

更关键的是，杂交瘤技术专门选用一种代谢缺陷型骨髓瘤细胞—— 它缺失HGPRT酶（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）或TK酶（胸腺嘧啶核苷激酶）， 这是后续HAT筛选能成功的关键。

骨髓瘤细胞本身不分泌抗体，避免了与目的抗体混杂的问题。

4.4 第四步：诱导细胞融合

4、三大类诱导方法

将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入诱导剂使其融合。动物细胞融合的方法分三大类：

• 物理法：电激（电融合）、离心、振动
• 化学法：聚乙二醇（PEG）——最常用，原理是利用其改变细胞膜的通透性
• 生物法：灭活的病毒（如灭活的仙台病毒）——利用病毒膜上的融合蛋白介导细胞膜融合

这三类方法都依赖于一个共同的物理基础——细胞膜具有流动性。

融合后会出现哪些细胞？

由于细胞融合是随机过程，融合率也远低于100%，融合体系中实际包含至少5–6种细胞：

• 未融合的B淋巴细胞
• 未融合的骨髓瘤细胞
• B–B 自身融合（同源融合）
• 瘤–瘤 自身融合（同源融合）
• B–瘤 杂交瘤细胞 ✨ 我们想要的！
• 多个细胞融合的多核细胞

所以——必须有”第一次筛选“！

4.5 第五步：第一次筛选——HAT选择培养基（重难点）

5、HAT 培养基的精妙设计

HAT 是三种关键成分的英文首字母：

• H = Hypoxanthine 次黄嘌呤
• A= Aminopterin 氨基蝶呤（叶酸的拮抗剂）
• T= Thymidine 胸腺嘧啶核苷

它的工作原理依赖于一个核心生物化学事实： 细胞合成 DNA 有两条途径。

                         图3 HAT培养基筛选三类细胞的命运对比

一句话总结HAT筛选的精髓：

氨基蝶呤关闭主路，迫使细胞走旁路；旁路需要 HGPRT 酶，骨髓瘤没有这酶；B细胞不能长期增殖。
只有“既有酶、又能增殖”的杂交瘤能存活——这是”基因互补”经典案例！

4.6 第六步：第二次筛选——克隆化培养与抗体检测

6、为什么还需要第二次筛选？

这是师生最容易混淆的关键点。第一次筛选只解决了”是不是杂交瘤”的问题， 但是——脾脏中有上百万种B细胞，每种识别不同的抗原表位。

所以，HAT筛出的所有杂交瘤细胞是一个”大杂烩”：有的分泌目的抗体，有的分泌无关抗体，有的甚至不分泌抗体。 第二次筛选就是要从这些杂交瘤中再挑出”专门分泌目的抗体”的那一种。

具体做法（有限稀释法）：

• ①将杂交瘤细胞悬液逐级稀释，稀释到平均每孔0.5–1个细胞。
• ②接种到96孔细胞培养板上，让单个细胞克隆增殖。
• ③培养一段时间后，取每孔上清液用ELISA（酶联免疫吸附试验）检测：能与目的抗原结合的就是”阳性孔”。
• ④挑出阳性信号最强的克隆。
• ⑤重复有限稀释3–4轮，以确保最终细胞群是真正的”单克隆”。

4.7 第七步：大规模培养，收获抗体

7、两条生产路线

• 体外培养：在生物反应器中大规模动物细胞培养，从培养液中收集分泌的抗体——更纯净，便于工业化。
• 体内培养：将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，从腹水中收集抗体——产量高、成本低，但伦理压力大、纯度较低。

经过分离纯化后，得到的就是高度均一、特异性极强的单克隆抗体。

PART 05
八大常见误区深度辨析

下面这8个问题，是笔者在多年备课、阅卷、答疑中见到的最高频的错误理解， 建议老师在讲课中重点澄清，学生在复习中重点关注。

误区 01

融合用的是”B细胞”还是”浆细胞”？

人教版教材选必三明确写”B淋巴细胞”，所以一定是B细胞，不能说浆细胞。

 这个问题需要辩证看。从免疫学严格意义讲，分泌抗体的是浆细胞（活化分化后的B细胞）。 但浆细胞高度分化，已基本失去分裂能力，因此教材在叙述时使用”能产生抗体的B淋巴细胞“这一更宽泛的表达—— 它实际包含了浆母细胞、浆细胞和未完全分化的活化B细胞。（注：课本里的“B淋巴细胞”在约定俗成的语境下，特指“还没走到终末、还能分裂的那个抗体生产细胞”。）
答题时按照人教版教材的表述：”经免疫的B淋巴细胞”或”产生特异性抗体的B淋巴细胞”为最稳妥， 高考评分参考答案两种说法都接受。

误区 02

两次筛选的目的是一样的吗？

两次筛选都是为了筛出杂交瘤细胞，所以重复一次更纯。

 两次筛选目的完全不同，绝非简单重复！

• 第一次筛选（HAT）：筛选”是不是杂交瘤细胞”——解决细胞类型问题
• 第二次筛选（克隆化+抗体检测）：筛选”杂交瘤分泌的是不是目的抗体”——解决抗体特异性问题

误区 03

HAT 培养基直接”杀死”非杂交瘤细胞？

HAT 培养基中加入了”毒药”，能毒死除杂交瘤外的所有细胞。

 氨基蝶呤不是毒药，它是叶酸的结构类似物（拮抗剂），作用机制是 竞争性抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断DNA合成的主路。
未融合的骨髓瘤细胞死亡的根本原因不是”被毒死”，而是主路被阻断后又没有旁路可走，无法合成DNA核苷酸而无法增殖。 未融合的B细胞死亡是自身寿命限制（不能体外长期存活），与药物无直接关系。

误区 04

融合后只有 3 种细胞？

融合后产生3种细胞：未融合B细胞、未融合骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞。

 这是常见的过度简化。实际融合体系中至少有5种主要类型：

1. 未融合的B细胞
2. 未融合的骨髓瘤细胞
3. B–B 自身融合
4. 瘤–瘤 自身融合
5. B–瘤 杂交瘤细胞（目标）

其中：B–B同源融合在HAT中也会因不能长期增殖而死亡；瘤–瘤同源融合也会因缺HGPRT而死亡—— 所以最终HAT筛选确实只剩下”B–瘤杂交瘤”。

误区 05

动物细胞融合可以用 PEG，植物细胞也可以用 PEG？

PEG只能用于动物细胞融合，植物体细胞杂交用其他方法。

 PEG（聚乙二醇）既能用于动物细胞融合，也能用于植物原生质体融合。 两者真正的关键差异是：

	动物细胞融合	植物体细胞杂交
前处理	无需特殊处理	必须先去除细胞壁（纤维素酶+果胶酶）形成原生质体
物理法	电激、振动	电激、离心
化学法	PEG	PEG
生物法	灭活的病毒 ✓	无（病毒无法跨细胞壁/原生质膜识别，无法诱导融合）

所以，“灭活的病毒”是动物细胞融合特有的诱导方法，这是高考易考点。

误区 06

“灭活”的病毒还能起作用吗？

病毒被灭活后就完全失去了功能，不能再促进细胞融合。

 “灭活”的准确含义是：用物理或化学手段使病毒失去感染（侵染细胞、复制增殖）的能力，但保留其他生物活性。
灭活的仙台病毒虽然不能感染、复制了，但其表面的融合蛋白（F蛋白）和血凝素（HN蛋白）依然有活性， 能介导宿主细胞膜彼此融合。

误区 07

“单克隆”=只来自一个细胞？

既然叫”单克隆”，那制备过程中只用一个B细胞就够了。

 “单克隆”指的是最终用于生产抗体的细胞群来自一个共同的祖先细胞（一个杂交瘤细胞克隆增殖而来）。 但制备过程从一开始就需要大量细胞—— 成千上万的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，这是因为细胞融合的成功率很低（万分之一以下）， 必须从大量细胞中通过两次筛选才能”挑”出我们想要的那一个克隆。
“单克隆”是结果，不是起点。

误区 08

动物细胞融合 = 动物细胞培养？

这两个名称很像，应该是同一种技术。

 这是两种独立但相关的技术——

• 动物细胞培养：把动物细胞放在适宜的条件下让它们生长和增殖。它是动物细胞工程的基础技术。
• 动物细胞融合：把两个或多个动物细胞合并成一个细胞。这是制备杂交瘤的核心步骤。

制备单克隆抗体的过程同时用到这两种技术——融合需要培养，培养包括融合后的多次筛选培养。

PART 06
单克隆抗体的应用：从实验室走进生活

6.1 作为诊断试剂

单克隆抗体由于特异性强、灵敏度高，是各类快速检测试纸的核心材料。

• 早孕试纸：检测尿液中的人绒毛膜促性腺激素（HCG）。
• 新冠/流感抗原检测：检测病毒表面的特异性蛋白（如新冠N蛋白、刺突蛋白）。
• 癌症早筛：检测特定肿瘤标志物（AFP、CEA、PSA等）。
• 科研基础：免疫荧光、Western blot、流式细胞术、ELISA等几乎所有免疫学技术都要用到单抗。

6.2 用于疾病治疗——”生物导弹”（ADC）

将抗癌药物或放射性同位素偶联到单克隆抗体上，单抗会”识路”找到肿瘤细胞表面的特异性抗原， 然后把药物精准递送到肿瘤组织，对正常细胞损伤小、毒副作用低——这就是著名的 “生物导弹”。注意：单克隆抗体在这里起靶向运输的作用，而药物起杀伤或治疗的作用。

6.3 免疫治疗的明星药物

近年来风靡全球的免疫检查点抑制剂——比如帕博利珠单抗（PD-1抗体，俗称”K药”）、 阿替利珠单抗（PD-L1抗体）、伊匹木单抗（CTLA-4抗体）—— 它们都是通过单克隆抗体技术制备的，通过解除免疫细胞的”刹车”，让T细胞重新识别并杀死肿瘤细胞。 这一发现获得了2018年诺贝尔生理学或医学奖。

从鼠源到全人源：抗体药物的进化

早期单抗都是鼠源的，输入人体后会引起免疫排斥（产生HAMA抗体）。 经过几十年的工程化改造，单抗经历了：

• 鼠源单抗（100%鼠源）→ 1986年首个上市
• 嵌合抗体（约30%鼠源）
• 人源化抗体（约5–10%鼠源）
• 全人源抗体（0%鼠源）

PART 07
教学建议：如何讲好这一节？

给老师的建议

• 讲课顺序建议是：”概念→原理→流程→筛选→应用”，先讲清楚”为什么要做”再讲”怎么做”。
• HAT原理虽超出教材，但不讲清楚学生根本理解不了”两次筛选”的本质。建议用图3的方式简化呈现。
• 多类比：”单克隆”就像”一棵苹果树长出的所有苹果都来自同一棵树”——这有助于学生理解”克隆”的本质。
• 结合时事——新冠抗原检测、PD-1药物、医美中的肉毒素抗体，都是绝佳引入素材。

给学生的建议

• 背诵流程是必要的，但更重要的是理解每一步”解决了什么问题”——这是高考简答题的得分关键。
• 建立联系：单克隆抗体 ←→ 体液免疫；动物细胞融合 ←→ 植物体细胞杂交；HAT筛选 ←→ DNA合成、基因互补。
• 遇到陌生情境题（如新型病毒检测）不要慌——所有题目都是同一套原理的变形。

来源网址：单克隆抗体制备的详细过程·全解析