生物老师划重点：2025陕西卷基因工程“马铃薯抗寒”题，讲清引物、同尾酶与T-DNA！

 

来源公众号：师者解忧馆

很多同学做基因工程题，最怕遇到限制酶选择和引物设计。2025年陕晋宁青卷的压轴题，就是围绕“把野生马铃薯的抗寒S基因，导入栽培马铃薯”这个真实科研案例展开的。它把PCR引物修饰、同尾酶的使用、T-DNA整合和植物组织培养这四个知识点串联了起来。今天，我们就以这道题为例，掰开揉碎，把每个空的原理都讲清楚。

一、题目速览

（2025·陕晋宁青）

二、第(1)小题：PCR的“基本盘”

第1空：PCR扩增需要什么原材料？
答案：4种脱氧核苷酸（或4种脱氧核苷三磷酸）

PCR就是体外的DNA复制。它需要的“建材”是4种脱氧核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）。注意，不是核糖核苷酸，是脱氧的。

第2空：DNA聚合酶在哪个步骤干活？
答案：延伸

PCR的三个步骤是变性（高温解链）、退火（引物结合）、延伸（DNA聚合酶工作）。DNA聚合酶的核心工作，就是从引物的3’端开始，把一个个脱氧核苷酸连上去，合成新链。这个步骤叫延伸。

三、第(2)小题：引物的“定向改造”与“同尾酶”的妙用

这道题最核心、最难的考点都在这里。

第1空：限制酶序列加到引物的哪一端？

答案：5’端

为什么？PCR扩增出来的目的基因两端是平头的。限制酶只能识别特定的DNA序列并切割，所以我们必须给扩增出来的基因戴上“识别帽子”。这个帽子不能加在引物的3’端，因为3’端要负责延伸，加了帽子会妨碍DNA聚合酶工作。所以，帽子只能加在引物的5’端。

第2、3空：选择什么限制酶？添加什么序列？

答案：AGATCT； BamH I、EcoR I

这是最需要动脑筋的地方，我们来分步推理。

1.原则：不能破坏“关键部件”。

我们要构建表达载体。目的基因（S基因）本身不能被破坏，载体上的重要区域（启动子、终止子、T-DNA边界等）也不能被破坏。S基因内部有Xba I、Nde I和BamH I等酶切位点，所以这些酶不能用。

2.确定载体的酶切位点。

我们只能在载体上找合适的酶切位点。根据示意图，载体的启动子和终止子之间，有BamH I、EcoR I和Xba I。Xba I和BamH I已经被排除了，所以载体可以用的酶是EcoR I。

3.“同尾酶”救场。

我们想让S基因和载体用同一种限制酶切割后的末端连接。载体用BamH I切割，那S基因也应该用BamH I切割，但S基因内部有BamH I，不能用。怎么办？这就需要“同尾酶”来帮忙。什么是同尾酶？ 不同的限制酶，但能识别不同序列，切割后产生相同的黏性末端。观察限制酶识别序列表，发现BamH I的识别序列是GGATCC，Bgl II的识别序列是AGATCT。它们切割后产生的黏性末端是完全一样的（都是GATC-3’突出）。用Bgl II和BamH I分别切割DNA，它们的末端就能互补配对连接。

4.确定最终方案。

载体切割酶：BamH I 和 EcoR I。

S基因切割酶：用Bgl II（BamH I的同尾酶）和EcoR I。这样，S基因和载体就能通过相同的末端连接在一起。上游引物添加序列：上游对应的就是Bgl II的序列，即5′-AGATCT-3′。

一句话总结：因为S基因内部有BamH I，所以我们用它的同尾酶Bgl II，在引物的5’端添加Bgl II的识别序列，这样S基因和载体就能完美对接。

四、第(3)小题：T-DNA整合与植物组织培养

第1空：S基因最终整合到哪里？
答案：栽培马铃薯愈伤组织细胞的染色体上

农杆菌转化的核心，就是它质粒上的T-DNA片段。这个片段能把我们想要的目的基因运送到植物细胞里，并整合到植物细胞的染色体DNA上。这样，目的基因就能稳定遗传给后代。

第2空：用哪个抗性基因筛选转化细胞？
答案：2

看图，载体上有两个抗性基因：抗性基因1（在T-DNA外部）和抗性基因2（在T-DNA内部）。

抗性基因1：在T-DNA外部。它不进入植物细胞，只用来筛选成功导入了重组质粒的农杆菌。

抗性基因2：在T-DNA内部。它会随着T-DNA一起进入植物细胞。所以，我们用它来筛选被成功转化的植物细胞（即成功插入了S基因的细胞）。因此，这里填2。

第3空：愈伤组织如何变成植株？
答案：再分化

植物组织培养有两个关键步骤：脱分化和再分化。脱分化是指已经分化的细胞（比如叶片细胞）变成一团未分化的细胞（愈伤组织）。再分化则是让愈伤组织重新长成芽和根，形成完整的植株。这个过程叫再分化。

五、核心知识点总结

序号	关键结论
1	PCR需要4种脱氧核苷酸做原料，DNA聚合酶在延伸步骤中工作。
2	PCR引物要加限制酶识别序列，必须加在5’端。
3	限制酶避免破坏目的基因和载体上的关键区域。
4	当目的基因内部有目标限制酶时，可以用同尾酶“曲线救国”。
5	同尾酶切割后产生相同的黏性末端，可以互相连接。
6	T-DNA的作用是将目的基因整合到植物细胞的染色体上。
7	T-DNA内部的抗性基因，用于筛选被成功转化的植物细胞。
8	愈伤组织到植株要经过再分化。

高考题看着复杂，但拆开看，无非就是这些基础原理的排列组合。把这几个核心弄懂了，以后再遇到类似的题，你也能游刃有余。收藏起来，考前翻一翻，你也能成为解题高手！

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