2025山东高考基因工程压轴母题告诉你黏性末端补平、反式PCR玄机！

 

来源公众号：师者解忧馆

高考生物压轴题难到想放弃？尤其是最后那道基因工程题——情境新、信息多、步骤长、细节密。很多同学一看到就头皮发麻，甚至直接跳过。今天，我们就以2025年山东高考生物第25题为例，逐空精讲，掰开揉碎给你看。

一、题目速览

（2025·山东）25. 种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。

（1）Ti质粒上与其在农杆菌中

（2）为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为_____（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段_____，才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为_____（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”）。

（3）通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生型基因，_____（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。

二、第(1)小题·质粒构建逻辑

第1空：复制原点

答案：复制原点

质粒能在农杆菌里自己复制，靠的就是复制原点。没它，质粒就“断子绝孙”了。送分题。

第2空：选哪种酶切Ti质粒？

答案：Xba I

三个关键规则：

1.不能破坏LB、RB、T‑DNA区域、卡那霉素抗性基因等。 酶切位点选择排除BamHI（会破坏终止子），可选XbaI和PstI（均产生黏性末端）。

2.末端补平：DNA聚合酶只能从5’往3’延伸，所以必须选切出5’突出末端的酶。只有XbaI切出的黏性末端(5′磷酸突出的末端)可以作为模板，在DNA聚合酶的催化下，从其互补链的3′-OH开始连接脱氧核苷酸补平黏性末端，如图1所示。

3.PstI切出的黏性末端是3′端突出的末端，无法作为模板，无法从其互补链的5′-P基团开始连接脱氧核苷酸，如图2所示。

第3空：补平时用什么酶？

答案：DNA聚合酶

黏性末端补平，需要以DNA链为模板，一个一个加脱氧核苷酸。这个活儿DNA聚合酶干得了。DNA连接酶只管连磷酸二酯键，干不了补平的活。

第4、5空：正向还是反向？靠双酶切判断

答案：Spe I 和 Sma I；550

1.关键前提：目的基因与质粒连接后，无论正向还是反向，形成的都是环状重组质粒——不是线性，一定是环。

2.Sma I切出的平末端和补平的Xba I的黏性末端连接后形成的重组位点，两个限制酶识别序列消失，另一边2个SmaI位点连接后形成的重组位点仍然能保留该酶切位点。

3.能切出较准确片段的只剩下Sma I和基因内的Spe I两个酶切位点。

4.在进行目的基因和载体连接过程中，由于使用了单酶切，因此，存在载体自连、载体串联、载体和单一基因连接及载体和串联基因的连接等情况，但无论何种连接方式，只有单基因和单载体的连接片段在Sma I和Spe I切割下能出现一长一短两条带，且短的条带为约550bp才是正向连接(图3)。而反向连接的片段切出的较短条带是200bp(图4)。因此，第4问的空填写“Sma I和Spe I”，第五问的空填写“550”。

5.一句话结论：短条带是550 bp → 正向；短条带是200 bp → 反向。

6.同尾酶陷阱：如果用了同尾酶连接黏性末端，连接后的杂交序列，两种原酶都切不动。高考高频坑，记住了。

二、第(2)小题—反式PCR玄机

这里考的是反式PCR（反向PCR），专门用已知序列扩旁边未知的序列。

第1空：选几个碱基的识别序列？
答案：4
要求限制酶能在基因组中切割更多更小的片段，识别序列长度为4、6、8个碱基的限制酶在基因组中理论上分别为每4⁴、4⁶、4⁸碱基对区域内会有一个酶切位点。因此，选择识别序列为4个碱基对的酶切割小麦基因组可产生更短的切割序列，连接后有利于后续PCR进行。

第2空：必须做什么？
答案：环化（自身环化）
线性DNA上，引物P1和P2方向相反，扩不出东西。把DNA片段自己连成环，引物方向就对了，扩增才能跑起来。

第3空：电泳还是测序？
答案：测序和序列比对
电泳只能看长度、大小，无法确定碱基序列，而测序和序列比对能判断两条未知序列是不是同一个基因。

三、第(3)小题·整合≠表达

问：如果检测到野生型基因，能不能确定植株表型是野生型？ 
答案：不能

基因整合进去了，不代表它就乖乖转录、翻译、干活了。基因可能沉默，可能表达量不够。只有等蛋白质实实在在表达出来，表型才能恢复。检测到基因只是第一步，离表型还差十万八千里。

四、核心知识点

序号	关键结论
1	质粒结构：复制原点、标记基因，一个不能少
2	选限制酶：别搞坏关键区域
3	5’突出能补平，3’突出不行
4	补平用DNA聚合酶，别搞混DNA连接酶
5	正向反向连接都变成环状质粒
6	双酶切片段长度取决于环上两切点的距离
7	同尾酶连的位点，原酶一个都切不动
8	反式PCR：已知扩未知，得先环化
9	整合 ≠ 表达

高考压轴题，看着唬人，拆开看全是基础。细节抓稳了，原理搞透了，再难的题也不过是简单题的排列组合。收藏起来，考前翻一翻！

来源网址：生物老师划重点：2025山东高考基因工程压轴母题告诉你黏性末端补平、反式PCR玄机！