基于高考试题解读和拓展“反向PCR测序技术”

 

王静雯　李乐
江苏省扬州大学附属中学

摘要：以分析未知序列的反向PCR高考试题为切入点，对测序技术的扩增依赖性、以限制酶识别序列进行引物设计的缺陷、酶切后如何进行环化、环状模板线性扩增机制、测序后的片段分析检验方法等教学疑点进行解读，并拓展了反向PCR的相关应用。

2025 年高考浙江卷的24题以反向PCR（聚合酶链式反应）分析未知序列为情境，综合考查限制酶、DNA连接酶、反向PCR原理及引物设计逻辑，强调对基因工程工具和分子生物学技术的理解与应用。

原试题节选：1,3-磷酸甘油脱氢酶（GPD）是酵母细胞中甘油合成的关键酶。以某假丝酵母菌株为材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脱氢酶的基因（GPD）。采用的方案是：先通过第1次PCR扩增出该基因的中间部分，再通过第2次PCR分别扩增出该基因的两侧，经拼接获得完整基因的序列，如图1所示，回答下列问题。

图1基因序列扩增方案

1）分析不同物种的GPD蛋白序列，确定蛋白质上相同的氨基酸区段，依据这些氨基酸所对应的___，确定DNA序列，进而设计1对引物。以该菌株基因组DNA为模板进行第1次PCR，利用凝胶电泳分离并纯化DNA片段，进一步测定PCR产物的序列。在制备PCR反应体系时，每次用微量移液器吸取不同试剂前，需要确认或调整刻度和量程，还需要___。

2）为获得完整的GPD基因，分别用限制性核酸内切酶PstⅠ和SalⅠ单酶切基因组DNA后，各自用DNA连接酶连接形成环形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质，最后加入___沉淀环形DNA。根据第1次PCR产物测定获得的序列，重新设计1对引物，以环形DNA为模板进行第2次PCR，最后进行测序。用于第2次PCR的1对引物，其序列应是DNA链上的___（A.P1和P2B.P3和P4C.P1和P4D.P2和P3）。根据测序结果拼接获得完整的GPD基因序列，其中的启动子和终止子具有___功能。

该试题以创新性情境设计为依托，聚焦生物学核心素养的深度考查。本题表述高度凝练，蕴含多维信息架构。其中，反向PCR技术原理的呈现尤其值得关注，因其涉及环状DNA扩增机制和引物方向性设计等抽象概念，暴露出了中学教学实践中的一些认知盲区：部分教师对关键技术要点（如限制性内切酶的作用时序、DNA连接酶的热稳定性）的理解存在偏差，这种认知偏差直接导致试题命制与解析过程中科学严谨性的缺失。

反向PCR作为PCR技术的变体，契合高中生物学课程标准的要求，能完善学生对PCR技术体系的认知；深化学生对核酸扩增原理的理解，培养学生的辩证思维能力，其在实验设计、结果分析等环节具有不可替代的教学价值。浙江高考题再次考查反向PCR相关知识点，进一步印证了其在高考中的重要地位。基于此，本研究通过文献分析与技术原理溯源，系统解析反向PCR的关键技术环节，并对相关问题进行解读。

1 已经获得基因片段不直接进行测序的原因

传统Sanger测序需满足μg至ng级模板量或pmol/L级引物浓度，且依赖已知侧翼序列设计引物。本试题中，假丝酵母经限制酶（如PstⅠ或SalⅠ）单酶切整个基因组DNA后，会产生很多个长度不一的DNA片段，可以分为包含完整目的基因和不含目的基因的2类片段。因未纯化导致非目的片段混杂，模板浓度不足且侧翼序列未知，无法满足Sanger测序条件。虽然Oxford Nanopore等单分子测序技术无须预知引物位点且模板需求低，但其单碱基原始错误率（约5%）、单位数据成本（Illumina测序的3～5倍）及读长数据处理对专用工具（如Medaka、Canu）的依赖性限制了其广泛应用。当前主流平台中，Illumina等2代技术须通过PCR扩增（如桥式扩增成簇）富集模板，而3代技术虽支持单分子测序，但低起始量样本仍需要全基因组扩增。如表1构建的测序技术代际特点与扩增依赖性矩阵所示，当前主流测序平台仍依赖PCR扩增实现模板富集，这从根本上决定了PCR在该测序流程中的重要性。

表1测序技术代际特点与扩增依赖对比

*注：第4代技术侧重空间原位检测，读长非主要指标

2 不能直接根据基因两侧的限制酶序列设计引物进行扩增的原因

试题呈现的图中可以看出GPD基因两端分别存在PstⅠ和SalⅠ的酶切位点，能否直接以酶切位点序列设计引物进行PCR？在进行PCR时，引物设计的相关原则及注意事项较多，直接使用限制酶识别序列设计引物不满足相关要求。

2.1 引物设计规范冲突

引物有效退火需要满足18～30 bp的长度要求且Tm≥55℃，但限制酶识别序列仅6 bp，其Tm值约12℃，结合特异性指数不足标准值的15%。且短引物在复杂基因组中随机匹配概率极高，这会使引物与模板发生大量非特异性结合，进而引发诸多非特异性扩增。

2.2 二级结构对扩增的阻碍性

GPD基因两侧存在未知序列，且限制酶位点周边序列常富含重复元件使模板形成稳定二级结构（如发夹或茎环），导致覆盖引物结合位点，使引物无法接触模板。即使部分二级结构在高温变性步骤中被打开，在降温退火时可能迅速重新形成，与引物退火形成竞争。即使引物与模板勉强结合，二级结构也可能阻碍聚合酶的移动，导致扩增提前终止。因此，在实际操作时，常避开此类区域。

3 酶切后如何进行环化

环化过程要考虑2个问题：1）限制酶还在反应体系中，此时加DNA连接酶无法将酶切后的GPD基因环化。2）因为分别对GPD基因进行单酶切后其两端的黏性末端相同，故酶切后的2类片段通过DNA连接酶进行连接时，不仅会发生分子内环化（单个片段首尾相连形成环状），也会发生分子间连接（多个片段首尾相连形成线性或环状多聚体）。在这些连接产物中，只有一小部分是目标环状分子，即包含了目标基因（GPD）及其上游（PstⅠ切点）或下游（SalⅠ切点）未知侧翼序列的环状DNA。如何减少非特异性环状DNA分子出现的概率？高中阶段的题目暂未考查相关知识，导致许多教师教学时忽视了这2个问题，但这是科研操作中必须要考虑到的问题。在高中生物学教学中讲解这些问题，能使学生理论联系实际，深入理解分子生物学知识，培养学生解决问题的能力和科学思维，为未来实验操作和科研工作奠定基础。因此，通过查阅资料，了解到实际实验过程规避以上问题的方法。

针对第1个问题，在实际操作时会在限制酶酶切之后进行65℃左右灭活,时长15～20 min，确保限制酶失活后再加入DNA连接酶进行连接。或通过有机溶剂（苯酚/氯仿）抽提去除蛋白质类酶，纯化DNA后重新调整缓冲体系进行连接反应。在该试题3）问的描述中则是用DNA连接酶连接形成环形DNA后，再用苯酚-氯仿抽提除去杂质。部分教师误认为该操作是为了区分不同类型的环状分子，但实则是纯化所有连接后形成的环状DNA混合物（去除蛋白质、盐分等杂质）。真正的筛选发生在第2次PCR：通过设计特异性引物，这些引物只能与目标环状分子上的已知序列结合（且方向正确），从而选择性地扩增出包含相邻未知序列的线性片段。非目标环状分子（如其他基因组片段环化形成的环、串联体形成的环）由于缺乏引物结合位点或引物方向不匹配，无法被有效扩增，或者在后续的电泳/测序分析中被排除。

针对第2个问题，在实际操作时会降低DNA质量浓度（如低于10 ng/μL），促进分子内环化（单个片段自身连接），抑制分子间连接（多个相同片段串联），或对连接时间进行控制，如缩短连接时间（如4 h），减少多聚体形成概率。

4 扩增得到何种目标产物

由试题1）可知，第1次扩增后测序分析得到了GPD基因中间的一段序列，将其定为已知序列。再根据第3节可知，后续的步骤依次为：使限制酶失活、加DNA连接酶进行连接反应、用苯酚-氯仿抽提除去杂质、根据中间已知序列设计特异性引物进行扩增。第2次扩增是为了获得已知序列两侧的未知序列，所以第2次扩增应该为反向扩增，对应的引物应该设计为序列2、3的反向引物，即3′端朝向外侧。因DNA聚合酶只能将游离的脱氧核苷酸连接到已有核酸片段的3′末端，所以在其作用下游离脱氧核苷酸会不断连接到特异性引物的3′端进行反向延伸。又因DNA连接酶在上一步的操作中被大量去除，少量残留的DNA连接酶在PCR的高温条件下失活，所以第2轮PCR的第1个循环延伸到引物的5′端后，无法催化最后一个磷酸二酯键的形成而出现缺口，结果形成2个带有断口的开环DNA分子。后续再以该开环DNA分子为模板经过第2、3个循环便能得到缺失部分已知序列的线性DNA分子。基于以上推理，能分析出添加序列为P2、P3的引物后所扩增出的产物，图2以PstⅠ酶切环化后的扩增为例进行演示。

由图2可知，一个环状DNA第3次扩增可以得到2条目的片段，所以扩增结束会得到大量的目的片段，且满足公式2ⁿ-2n(n代表循环次数）。由此，可推断若选择P1、P4序列的引物，在Taq酶作用下只能进行正向扩增，则最终会得到大量引物及其内侧的已知序列，如图3所示。

图2 PstⅠ酶切环化后选择序列为P2、P3的引物（用引物3、4代替）的扩增示意图

图3 选择序列为P1、P4的引物（用引物1、2表示）扩增结果示意图

5 如何对GPD基因片段进行测序、分析并比对

通过前面的扩增结果可知，第2次PCR的扩增产物主要为缺失部分已知序列的2种片段。可分别通过电泳的方法将其筛选出来。此时可以用3代测序技术（如Oxford Nanopore）直接对原始DNA模板进行单分子测序，无须扩增；或用2代测序（如Illumina）先通过PCR扩增（桥式扩增）生成DNA簇，在扩增过程中进行边合成边测序。用1代测序（Sanger法）则须通过PCR扩增目标片段后，再对纯化产物进行测序，所用的引物可以与前面选择的反向引物相同。测序结束得到了扩增产物的完整序列，须对测序片段进行分析，过程如图4所示。

图4测序结果的分析示意图

由图4可知，第1次PCR扩增是为得到该基因的中间部分，经测序分析后得到其序列，再根据其序列选择合适位置设计反向引物进行第2次PCR，从而分别扩增出该基因的两侧，再测序得到该基因两侧的序列，进行拼接后即获得完整基因的序列。具体的拼接逻辑如下：如图4所示，GPD基因从左到右分为3个序列，序列1为左侧PstⅠ识别序列到反向引物3的5′端对应的位置；序列2为反向引物3和4对应位置之间的序列；序列3为反向引物4的5′端对应的位置到最右侧的SalⅠ识别序列，序列1、3均不包含限制酶识别序列。引物3的5′端在图示扩增产物的最左侧，而PstⅠ识别序列在扩增产物的内部，由于限制酶识别序列是已知的，故在对测序后的序列分析时可知，由内部PstⅠ识别序列指向扩增产物的最左侧即为GPD基因的序列1，同理分析序列3应该为图示SalⅠ酶切环化后的扩增产物的最右侧，指向内部SalⅠ识别序列。综上所述，第1次PCR后测序得到了序列2，第2次PCR后经测序便能得到序列1和序列3，将其按照顺序拼接便能得到完整的GPD基因。获得完整的GPD基因序列后，利用生物信息学工具，特别是BLAST(basic local alignment search tool），将其与公共数据库中的基因组序列进行比对，确认该序列是否为目标基因，并确认其在染色体上的具体位置。以常见的白假丝酵母菌GPD1基因为例进行BLAST分析演示：假设通过测序后分析获得了一段序列，将其提交至BLAST服务器，选择blastn程序（用于核酸序列比对）和合适的数据库，其他参数设置默认，最后点击BLAST，结果如图5所示。

图5 blastn比对关键结果截图（英译中版）

图5展示了针对获得的白假丝酵母菌基因序列进行的blastn比对关键结果。分析首先确认了目标基因：序列与白色念珠菌（白假丝酵母）标准菌株SC5314的甘油-3-磷酸脱氢酶基因（GPD1）的mRNA序列完美匹配（查询覆盖率100%，一致性为100%,E值为0.0），证明所得序列即为目标基因GPD1。更重要的是，该序列与白假丝酵母菌株Fungi-01的完整染色体2序列也近乎完美匹配（查询覆盖率为100%，一致性为99.5%,E值为0.0）。这一关键匹配将GPD1基因精确定位于该菌株的染色体2上，为理解其基因组环境（如侧翼调控区域、邻近基因）奠定了基础。该结果清晰展示了反向PCR测序技术结合生物信息学分析（BLAST）在克隆基因身份验证及染色体精确定位中的强大作用。

6 反向PCR的应用

在高中生物学教学中，反向PCR技术的学习能够深化学生对分子生物学技术的理解，但只学习技术不了解实际应用会使学生陷入技术原理的机械记忆，难以建立“技术发明-科学问题-现实需求”的认知闭环，导致知识碎片化、迁移能力缺失，无法应对真实科研情境中的相关问题。因此，在原理学完之后，需要及时补充相关应用。利用无缝克隆技术构建重组质粒时，通常利用反向PCR将环状DNA变成线状DNA，暴露同源序列便于目的基因与载体进行同源重组；在克隆基因启动子时（如猪H-FABP基因5′调控序列），反向PCR通过环化酶切后的基因组DNA，利用已知序列设计反向引物，成功扩增出上游未知区域；在疾病研究中（如乳腺癌细胞9p21缺失断点定位），该技术通过连接断裂点两侧序列形成环状模板，精准解析染色体结构变异。此外，反向PCR还被用于构建蛋白截短体质粒（如TRAF6功能域研究）和分离组织特异性启动子（如小麦花粉特异基因PSG076)。这些应用案例覆盖了农业育种、医学诊断和基础研究等多个领域，体现了技术的前沿性和实用性。

来源：王静雯,李乐.基于高考试题解读和拓展“反向PCR测序技术”[J].生物学通报,2025,60(12):67-71.