琼脂糖凝胶电泳：原理、构造、步骤、用途和演示视频

 

 来源公众号：生物药笔记 作者：麋鹿先生

本文内容部分来源于网络，仅进行翻译、编辑和整理，版权归原作者所有，本文仅作为知识分享和学习使用，不用做商业用途，如存在侵权请联系公众号删除。

一、前言

当电流施加到含有带电物质的介质上时，这些物质将向相反的电荷迁移。根据它们移动的介质，其他特征（例如存在的物种的大小）会影响它们的运动，从而导致分离。这是电泳技术（如琼脂糖凝胶电泳）的基础，这些技术在生命科学中得到广泛应用。

琼脂糖凝胶电泳是一种用于生物化学、分子生物学、遗传学和临床化学的凝胶电泳方法，用于分离琼脂糖基质中的混合大分子群，如 DNA、RNA 或蛋白质。

琼脂糖凝胶电泳是最常见的电泳技术之一，操作相对简单明了，但具有很强的分离能力。琼脂糖凝胶由微小的孔组成，这些孔充当分子筛，根据电荷、大小和形状分离分子。

本文将从琼脂糖凝胶电泳的原理、构造、步骤、用途等方面，带大家全面了解。同时提供演示视频以便大家了解和学习。

二、什么是琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是一种电泳形式，用于根据核酸（DNA或RNA）片段的大小分离核酸片段。当施加电流时，带负电荷的DNA/RNA通过琼脂糖凝胶的孔向凝胶带正电荷的一端迁移，较小的片段迁移得更快。然后可以使用紫外线 （UV） 观察生成的条带。

然而，核糖核酸往往会形成二级结构，有时同片段有多个不同的结构，这会影响它的迁移方式。因此，观察到的波段并不总是代表其真实大小，并且图像模糊。因此，天然琼脂糖凝胶（条件不会破坏分析物的天然结构）往往不用于分析RNA大小。替代方法包括Northern印迹和变性琼脂糖凝胶电泳这些使用能够破坏次级结构的条件。

琼脂糖凝胶也可用于分离蛋白质，根据它们的大小和电荷（与DNA/RNA不同，蛋白质的电荷根据掺入的氨基酸而变化）。然而，由于琼脂糖凝胶的孔径较大，蛋白质通常在孔较小的聚丙烯酰胺凝胶上分离，从而为小分子蛋白质分子提供更高的分辨率。

因此，在本文重点介绍DNA琼脂糖凝胶电泳。

三、凝胶电泳的工作原理

琼脂糖是一种经过纯化的琼脂，是海洋红藻细胞壁的碳水化合物结构组成部分。琼脂糖是一种分子量约为120,000的无支链(线性)聚合物，含有800-1000个单糖。琼脂糖链由一种重复的异二糖-即-D-半乳糖和3,6-酐-α-L-半乳糖通过1-4糖苷键结合而成。双糖单位，也称琼脂二糖，通过a-1、3连接形成了一个链。

琼脂糖的结构单元

琼脂糖溶液加热并冷却后，就会形成凝胶基质。其孔洞直径从50到200纳米不等，由凝胶浓度控制。温度高于90℃，琼脂糖便会融化，变成无规卷曲。冷却后，两个琼脂糖链形成由氢键连接的螺旋纤维。进一步冷却至胶凝固点以下(通常小于40°C)，则会有更多氢键连接形成螺旋束网络，进而形成具有三维网格的凝胶。由于氢键，琼脂糖形成的凝胶加热可逆。因此，通过溶解含有目的片段的凝胶，可提取电泳分离出的核酸。

琼脂糖凝胶中的孔形成和温度诱导的状态转变

凝胶中包含的琼脂糖百分比会影响孔径，从而影响可能通过的分子的大小以及它们通过的速度。琼脂糖的百分比越高，孔径越小，因此能够通过的分子越小，迁移越慢。在分子生物学实验室中，0.7-1%琼脂糖凝胶通常用于日常DNA分离，可在0.2-10 kb范围内对片段进行良好、清晰的区分。使用较低百分比的凝胶可以分离较大的片段，但它们会变得非常脆弱且难以处理，而较高百分比的凝胶将提供更好的小片段分辨率，但较脆且可能凝固不均匀。

由于肉眼看不到DNA，因此在凝固过程中会在凝胶中掺入嵌入染料，例如溴化乙锭 （EtBr）。这会结合DNA并在紫外光下发出荧光，从而可以观察DNA片段。存在的 DNA越多，条带越亮。

将与上样染料混合的样品置于凝胶的一端，该凝胶浸入电泳缓冲液中。然后，电流通过凝胶槽两端的电极穿过凝胶。

琼脂糖凝胶电泳设置示意图。琼脂糖凝胶位于缓冲液罐中，将与负载染料混合的样品置于凝胶一端的孔中，并施加电流，使带负电荷的DNA向正极移动

当样品运行足够长以获得充分的分离时，将凝胶从槽中取出并放置在UV灯箱上。然后，嵌入染料可以观察样品条带，并与具有已知条带大小的DNA分子量Marker进行比较来确定它们的大小。迁移距离和片段大小之间的关系是非线性的。

四、琼脂糖凝胶电泳步骤

1. 凝胶的制备

• 称取适当质量的琼脂糖放入锥形瓶中。琼脂糖凝胶使用w/v百分比溶液制备。凝胶中琼脂糖的浓度取决于要分离的DNA片段的大小，大多数凝胶在0.5%-2%之间。缓冲液的体积不应大于培养瓶容量的1/3。

• 向含琼脂糖的培养瓶中加入电泳缓冲液。旋转混合。最常见的凝胶电泳缓冲液是TAE（40 mMTris-乙酸盐，1 mM EDTA）和TBE（45 mM Tris-硼酸盐，1 mM EDTA）。两者都有接近中性的pH值，有利于带负电荷的核酸。
• 熔化琼脂糖/缓冲液混合物。这通常是通过在微波炉中加热来完成的。每隔30秒，取出烧瓶并旋转内容物以充分混合。重复直到琼脂糖完全溶解。
• 加入溴化乙锭（EtBr）至浓度为0.5 μg/ml。或者，也可以在含有0.5 μg/ml EtBr的电泳缓冲液中电泳15-30分钟后对凝胶进行染色，然后在电泳缓冲液中脱色相同的时间。

注意：EtBr是一种致癌物，必须根据规定妥善处理。处理含有EtBr的凝胶时，应始终戴手套。可用于DNA染色的替代染料可用；然而，由于其敏感性和成本，EtBr仍然是最受欢迎的一种。

• 让琼脂糖在工作台上冷却或在65°C水浴中孵育。否则，凝胶托盘会翘曲。
• 将凝胶托盘放入灌注装置中。或者，也可以用胶带粘住凝胶托盘的开口边缘以制作模具。将合适的梳子放入凝胶模具中以创建孔。
• 将熔融的琼脂糖倒入凝胶模具中。让琼脂糖在室温下凝固。取下电泳梳，将凝胶放入凝胶盒中，确保孔位于负端（黑色电极）。或者，也可以将凝胶包裹在保鲜膜中并储存在4 °C直至使用。

2. 上样和DNA片段的分离

• 将上样染料（loading buffer）添加到要分离的DNA样品中。loading buffer通常以6X浓度（0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯蓝、30%甘油）制成。loading buffer有助于追踪DNA样品的移动距离，使样品-染料混合物更致密，它会沉淀在孔的底部。同时可以更容易准确地将样品移液到孔中，从而降低孔之间样品交叉污染的可能性。

• 尽量避免用移液器吸头接触孔的边缘，因为它们可能会破裂并让一个样品流入下一个样品。同时上样量不要超过孔的最大载量。
• 同时在运行凝胶时，添加含有已知大小的核酸参照样品（分子标准，Marker），用于目的样品大小的估计。但Marker上样量最好参照厂商推荐量，不宜过高，否则会造成条带污点并遮盖附近条带。
• 将电源编程为所需的电压（电极之间1-5V/cm）。通常可以120V持续35分钟左右，当然，这应根据使用的凝胶百分比和片段大小进行定制。
• 向琼脂糖凝胶施加电流会导致其加热，电压越高，热量就越高，因此当运行低百分比凝胶时，建议使用较低的电压以防止熔化。增加电压可以跑的更快，然而，这可能会导致“笑脸条带”，其中条带的每一端都向上弯曲，从而难以确定正确的条带尺寸。
• 添加足够的电泳缓冲液以覆盖凝胶表面。使用与制备凝胶相同的电泳缓冲液非常重要。
• 将电极从黑色到黑色、红色到红色的电极盖在电槽上，然后将电极插入电源组，也从黑色到黑色和红色到红色。
• 将凝胶盒的导线连接到电源。打开电源并验证凝胶盒和电源是否正常工作。
• 盖上凝胶盒的盖子。阴极（黑色引线）应比阳极（红色引线）更靠近孔。仔细检查电极是否插入电源中的正确插槽。
• 打开电源。运行凝胶，直到染料迁移到适当的距离。

3. 观察分离的DNA片段

• 电泳完成后，关闭电源并取下凝胶盒盖。
• 从凝胶盒中取出凝胶。从凝胶表面排出多余的缓冲液。将凝胶托盘放在纸巾上以吸收任何额外的电泳缓冲液。
• 从凝胶托盘中取出凝胶，将凝胶暴露在紫外线下。这通常使用凝胶成像系统完成。DNA条带应显示为橙色荧光条带。

4.演示视频

视频来自于文献1，版权归原作者所有，下载、转载等行为请注明原作者。

五、用途 

1.样品DNA的可视化：

确定样品中是否存在DNA–例如，可以确认DNA提取或PCR是否有效，因此在诊断测试的情况下可以确定样品是阳性还是阴性。

确定存在的DNA片段的大小–例如，如果进行PCR或限制性酶切，条带是否为预期大小？这可以确认基因工程实验是否成功，或者可能表明是否存在基因插入、缺失或重复区域，这可以用作某些遗传病的诊断工具。在为二代测序制备DNA时，用于文库制备的片段化DNA必须具有正确的大小，以便进行高效测序。

存在的DNA量–尽管有更准确的精确方法DNA定量，例如紫外-可见光谱法，当在凝胶上运行样品时，产生的条带强度可以粗略地了解样品中DNA相对于其他样品的量。

样品的清洁程度–虽然在某些情况下可能会出现拖尾条带，例如在运行整个基因组DNA 时，但PCR或限制性酶切通常可能会产生清晰、清晰的条带。弥漫条带或弥散条带可能表明PCR条件或引物不理想、消化不完全或存在干扰污染物，例如DNA样品中的 RNA。

2.分离DNA片段进行纯化下游应用（如克隆）需要DNA片段的地方，或在限制性酶切后，可能需要从总样品中的其他DNA片段中分离出特定大小的DNA片段。为此，可以在凝胶上用完消化或扩增的样品，并切除含有目标片段的凝胶片。

3.分离用于Southern印迹Southern印迹是一种用于检测样品中特定DNA序列的技术。然而，为了做到这一点，首先必须通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，然后才能探测目标序列。

4.电泳迁移率变化测定（EMSA）

EMSA，也称为凝胶迁移检测，用于检测蛋白质和核酸之间的相互作用。示例可能包括转录因子的结合、促进或阻止基因表达。当蛋白质与DNA片段结合时，它会改变它通过琼脂糖凝胶迁移的方式，从而产生“偏移”。因此，通过运行有和没有推定的DNA结合蛋白的DNA片段的不同组合，可以确定何时发生结合或未发生，从而确定靶序列。

来源网址：琼脂糖凝胶电泳：原理、构造、步骤、用途和演示视频