详解CRISPR-Cas9系统组成和工作机制

 

来源公众号：bioinfotec　作者：bioinfotec

原核生物（比如细菌）面对病毒的攻击，进化出了类似“免疫系统”的保护机制，其中最有名的就是 CRISPR-Cas系统。

它的原理就像“记仇本”+“智能导弹”：当病毒第一次入侵时，细菌会把病毒的一小段DNA保存下来，放进自己的“记仇本”——CRISPR 序列中。下次这个病毒再来，细菌就会根据这段“记仇信息”制造一小段引导RNA（crRNA），再配合 Cas 蛋白，就能像发射精准导弹一样，把病毒的DNA找到并切断，从而干掉病毒。

科学家把这种系统简化后应用到实验中，尤其是 CRISPR-Cas9 工具，现在已经成为非常强大的基因编辑手段。它可以用来“剪切”并修改各种细胞或生物的DNA，广泛用于科研和未来的疾病治疗。

发现历史

早在1987年，日本科学家Ishino及其团队在研究大肠杆菌碱性磷酸酶基因时，意外发现了这些不寻常的重复序列与spacer（间隔序列），这标志着 CRISPR 的最初发现。但他们当时并不知道这些序列的生物学功能。

到了1990年，Francisco Mojica 在其他原核生物中也发现了类似序列，并首次将其命名为“CRISPR”。然而这些序列的具体功能仍不清楚。

直到2007年，科学家们才通过实验确定 CRISPR 是原核生物抗病毒的关键免疫机制。

在深入研究了 CRISPR 机制之后，科学家意识到：这一系统不仅能在原核生物中防御病毒，也可以被应用于植物、人类及其他微生物的基因编辑。

2012年，Jennifer Doudna 和 Emmanuelle Charpentier 发现，只需提供合适的模板，CRISPR/Cas9 就能像“分子剪刀”一样精准编辑任意DNA。

从那时起，CRISPR/Cas9 成为了迄今为止最有效、高效且精确的基因编辑技术，并在多个应用领域被广泛采用。

CRISPR-Cas系统分类

根据 Cas 蛋白的结构和功能，CRISPR/Cas 系统可分为 I 类（包括 I 型、III 型和 IV 型） 和 II 类（包括 II 型、V 型和 VI 型）。I 类系统由多个 Cas 蛋白亚基构成的复合物组成，而 II 类系统仅使用一个 Cas 蛋白。

由于 II 型 CRISPR/Cas-9 系统结构相对简单，因此研究较为深入。

CRISPR-Cas9系统组成

引导 RNA（gRNA）和 CRISPR 相关蛋白（Cas9）是 CRISPR/Cas9 系统中的两个关键组成部分。

Cas-9 蛋白是首个被应用于基因编辑的 Cas 蛋白，来源于化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes，即 SpCas-9）。该蛋白是一种大型（1368 个氨基酸）多结构域 DNA 内切酶，负责切割目标 DNA，形成双链断裂，因此也被称为“基因剪刀”。

Cas9 蛋白的结构可以分为两个主要功能区：一个是识别区，用来结合引导 RNA；另一个是切割区，真正执行 DNA 剪切。识别区包含 REC1 和 REC2 两部分；而切割区则包括两个负责剪断 DNA 单链的区域（RuvC 和 HNH），以及一个识别 PAM 序列的区域，这个 PAM 序列的识别是 Cas9 能否正确找到目标 DNA 的前提。

天然的引导 RNA 包含两部分：一段短小的 crRNA，负责精准识别目标 DNA；另一段是 tracrRNA，结构更复杂，提供 Cas9 蛋白结合的平台。尽管在自然界中这两部分是独立的，但在实验中，为了简化操作，科研人员将二者合成为一体，称为单一引导 RNA（sgRNA），这样就能灵活靶向和编辑任意基因序列。为了能够切割 DNA，在引导 RNA 的 3′ 末端，必须存在一个由 2 到 5 个核苷酸组成的特定 DNA 序列（该序列的具体内容取决于产生该 Cas9 的细菌种类），这个序列被称为PAM（原间隔序列邻接基序）。

CRISPR-Cas9工作机制

CRISPR-Cas9系统的工作机制主要可以分为三个阶段：适应（adaptation）、表达（expression）和干扰（interference）。

在适应阶段，细菌通过 Cas9蛋白识别入侵的噬菌体（病毒）基因组中的特定短序列，这些序列被称为“原间隔序列”（protospacers）。Cas9蛋白切割这些序列，并将它们插入到细菌自身基因组中的 CRISPR 阵列里，这个过程依赖于靠近 protospacer 的一个保守短序列，叫做“原间隔序列邻近基序”（PAM）。PAM 的存在对于识别和切割是必不可少的。

进入表达阶段后，插入的间隔序列和相邻的重复序列会被转录成一种叫做前体 CRISPR RNA（pre-crRNA）的长 RNA 分子。pre-crRNA 经过加工切割，生成成熟的 crRNA，这些 crRNA 包含了识别外来 DNA 的序列信息。在CRISPR-Cas9系统中，还有另一种 RNA 分子叫做转激活 crRNA（tracrRNA），它能与 pre-crRNA 结合，形成双 RNA 结构，起到稳定和引导 Cas 蛋白的作用。

在干扰阶段，成熟的 crRNA 和 Cas 蛋白复合形成一个复合体，这个复合体会在入侵的病毒基因组中寻找与 crRNA 匹配的序列。一旦匹配成功，Cas9 蛋白中的核酸酶会切割病毒 DNA，最终破坏病毒基因组，实现免疫防御。

CRISPR-Cas 基因编辑

科学家们将这种天然免疫系统改造为基因编辑工具。通过人工设计 crRNA 的序列，可以让 CRISPR-Cas 系统靶向并剪切任何感兴趣的基因区域，从而成为一把高效精准的“分子剪刀”。

基因编辑的核心步骤是先由 Cas 蛋白在目标 DNA 位置制造双链断裂（DSB），然后由细胞内的 DNA 修复机制修复这些断裂。细胞修复 DSB 主要有两条路径：

同源定向修复（HDR）

细胞利用一段带有与断裂两端相同或相似序列的 DNA 作为模板，通过同源重组修复断裂。如果在基因编辑实验中提供了一个带有所需序列变化的“供体模板”，细胞就会将该模板序列插入断裂部位，实现精准的基因修改。

非同源末端连接（NHEJ）

断裂的 DNA 直接连接起来，但这一过程经常伴随着碱基的随机插入或缺失（indels）。如果这些 indels 不是 3 的倍数，可能导致移码突变，进而破坏基因功能，这种方式适合于敲除基因。

通过以上两个修复途径，CRISPR-Cas 系统不仅能破坏目标基因，还能实现精准的基因编辑，因此在生物医学中得到了广泛应用。

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