质粒元件组成及构建方法

 

来源公众号：生物帮SA

前期有朋友留言想要咨询关于质粒单一原件组成及构建方法，因此我们邀请生物帮SA成员撰稿。

无论是蛋白表达、基因敲除，几乎所有的分子实验都离不开质粒。看似复杂的质粒，其实是由一系列功能明确的元件组装而成。只要掌握这些“模块”的属性和组合逻辑，我们就可以根据自己的需求构建出对应的功能性质粒。本文将介绍质粒的重要原件组成以及质粒构建方法。

🧫单一原件质粒的单一元件指的是一个独立的功能模块。从下面这张质粒图可以看到比较重要的几个模块

对于一个质粒，一般包括以下元件：

功能模块	作用说明	常见选择
复制起点（Ori）	决定质粒在宿主细胞中的复制能力与拷贝数	ColE1、pUC、p15A
抗性基因	用于抗生素筛选阳性克隆	AmpR、KanR
启动子（Promoter）	决定基因的表达时空与强度	CMV、EF1α、T7、U6
编码序列（CDS）	目标蛋白/功能RNA的表达框架	GFP、Cas9、CARF
标签（Tag）	用于纯化、定位或免疫检测	His、FLAG、HA、GFP
终止子（Terminator）	终止转录、增加mRNA稳定性	SV40 polyA、BGH polyA
多克隆位点（MCS）	包含多个酶切位点，便于插入目标基因	NdeI、AscI

（1）复制起点（ori）：控制质粒在宿主细胞（如大肠杆菌）中复制。例：ColE1（高拷贝数，适合克隆）或pSC101（低拷贝数，适合稳定遗传）。

Ori   名称	宿主类型	拷贝数	特点
ColE1	大肠杆菌	中高拷贝	最常用，兼容 pUC 系列
pUC ori	大肠杆菌	超高拷贝	改造自 ColE1，表达量高
p15A	大肠杆菌	低拷贝	与 ColE1 兼容，可双质粒共转
SV40 Ori	哺乳动物	中拷贝	需 SV40 T 抗原辅助复制
oriP/EBNA1	哺乳动物	稳定拷贝	在含 EBNA1 蛋白的细胞中维持复制

（2）抗性基因：用于筛选含质粒的细胞，通常是抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因（ampR）或卡那霉素抗性基因（kanR）。

（3）启动子：控制目标基因转录，不同表达系统中启动子的选择是不同的。

启动子	类型	应用场景	特点
CMV	哺乳动物强启动子	过表达、瞬时转染	表达强，广谱
EF1α	哺乳动物中强启动子	稳定表达系统	活性稳定，不易沉默
SV40	哺乳动物	报告基因驱动	中等强度
U6 / H1	RNA Pol III 启动子	sgRNA/shRNA 表达	控制非翻译RNA
T7	原核表达（体外转录）	体外表达系统	需T7 RNA聚合酶
lac / trc / tac	可诱导原核启动子	IPTG 诱导表达蛋白	适合大肠杆菌表达蛋白

（4）目标基因/标签：该模块用于编码目标蛋白/标签。

（5）终止子：终止子是基因末端的DNA序列，负责终止转录并确保RNA分子正确加工。

（6）多克隆位点（Multiple Cloning Site，MCS）：MCS区域包含多种限制性酶切位点，通过酶切和重组引入外源基因。

🧬 构建功能质粒的模块化思维

一个典型的质粒可以分为骨架模块和表达模块两大部分：

1. 骨架模块（Backbone）

这是所有质粒的“基础设施”，确保质粒能在宿主中复制、筛选。通常包括：复制起点（Ori）；抗生素抗性基因（如 AmpR）

2. 表达模块（Expression Cassette）

这是质粒实现功能的“工作单元”，其结构一般为：[启动子] – [目标基因] – [标签] – [终止子]

另外根据个人需求可以加入个性化序列，例如这里的f1 ori使质粒在 M13 感染细胞中生成单链 DNA，便于测序或突变。

🧫构建功能质粒的步骤

1. 定义研究目的

明确这个质粒的功能——表达蛋白？RNA干扰？基因编辑？抗性筛选？

2. 挑选功能元件

根据实验目的以及各个元件的功能进行选择，各个元件的功能及应用场景见上面的内容。

3. 设计连接方式

（1）限制性内切酶 + T4 DNA连接酶

🔹原理

利用内切酶识别特定位点切割质粒和目的片段，使之产生互补的“粘性末端”或“平末端”，再通过连接酶（T4 DNA ligase）将片段与载体连接。

T4（Genetic Education）

🔹优点

·技术成熟、操作简便

·实验成本低

·适合初学者或经典构建任务

🔹缺点

·需确保没有干扰性限制酶位点

·多片段连接困难

·通常会在连接处留下“酶位点痕迹”

🔹适用场景

构建简单表达载体（如插入一个目的基因）

（2）Gibson Assembly（无缝连接法）

🔹原理

将具有重叠序列（15–40 bp）的片段在等温反应中用 5′ 外切酶、聚合酶和连接酶处理，实现片段的无缝拼接。

Gibson Assembly （Molecularcloud）

🔹优点

·无需限制酶，连接处无痕

·支持多片段一次性连接

·整个反应只需一个管、一个步骤

🔹缺点

要求精确设计重叠区

对 DNA 片段纯度、量要求高

成本略高于传统方法

🔹适用场景

大于2个片段拼接；构建复杂表达盒；CRISPR载体拼接等

（3）Golden Gate Assembly

🔹原理

使用 Type IIS 限制酶（如 BsaI、BsmBI）识别位点切割位点在识别序列外侧，可通过设计使连接片段按顺序无缝拼接。

Golden Gate Assembly（SnapGene）

🔹优点

·支持模块化、标准化构建

·单管反应，效率高

·无缝拼接，连接顺序可控

🔹缺点

·对 Type IIS 酶识别位点敏感，需避免片段内含有相应位点

·初次设计较复杂

🔹适用场景

高通量克隆、合成生物学、植物载体构建、模块化表达系统

（4）In-Fusion Cloning（同源重组型克隆）

🔹原理

利用 15 bp 左右的同源臂，通过专用酶（如Clontech 的In-Fusion 酶）将 PCR 产物直接插入线性化载体。

In-Fusion Cloning（Takara Bio）

🔹优点

· 无缝连接、无需限制酶

· 操作快速、结果可靠

· 可连接多个片段

🔹缺点

· 需使用专用试剂盒，成本较高

· 连接效率依赖于同源臂设计质量

🔹适用场景

快速插入表达框；构建融合蛋白；需要精确无痕插入的项目

4. 模拟质粒结构

使用软件如SnapGene，将每一个模块按顺序拼接起来，并检查：阅读框是否连贯；限制酶位点是否重复；元件间有无功能冲突；有无不必要的重复序列

来源网址：质粒元件组成及构建方法