单克隆抗体制备中细胞融合如何实现？原理与方法详解

 

来源公众号：生物奇迹biomiracle

在单克隆抗体制备领域，细胞融合是获得杂交瘤细胞的关键环节。为何要将 B 淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？如何通过技术手段实现二者的有效结合？PEG 法作为常用技术，其具体操作步骤和核心要点是什么？

细胞融合原理

单克隆抗体制备需要结合两种细胞的优势特性。免疫动物脾脏中的 B 淋巴细胞，经抗原刺激后能够分泌特异性抗体，但在体外培养时存活时间不长，一般只能存活 1 – 2 周，无法持续增殖。而骨髓瘤细胞源自小鼠骨髓瘤，具备无限增殖的能力，不过它天然状态下不会分泌抗体，并且通常缺少次黄嘌呤 – 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT⁻）或胸腺嘧啶激酶（TK⁻），其合成 DNA 依赖从头合成途径。

细胞融合的目的，就是将 B 淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合在一起，让两种细胞的遗传物质相互重组。这样得到的杂交瘤细胞，既能保持 B 细胞分泌抗体的功能，又能获得骨髓瘤细胞无限增殖的特性。同时，由于杂交瘤细胞保留了 B 细胞的 HGPRT，在后续的 HAT 筛选培养基中能够存活下来，而未融合的骨髓瘤细胞会因为缺乏 HGPRT 或 TK 而死亡。

从细胞膜的层面来看，细胞膜由磷脂双分子层构成，本身具有流动性。在物理、化学或生物因素的作用下，细胞膜的脂双层结构会暂时被破坏。比如使用化学试剂 PEG（聚乙二醇）时，它作为脱水剂，能减少细胞间的水分，使细胞膜脂分子排列变得紊乱，降低膜表面电荷的排斥力，让相邻细胞的细胞膜紧密接触，最终形成融合孔，实现细胞融合。

细胞融合方法（以 PEG 法为例）

01 细胞准备

骨髓瘤细胞培养：在单克隆抗体制备中，常用小鼠来源的 SP2/0、NS0 或 P3 – X63 – Ag8.653 等骨髓瘤细胞株，这些细胞都属于 HGPRT⁻或 TK⁻类型，以便后续在 HAT 筛选培养基中筛选。培养时，使用含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基，在 37℃、5% CO₂的培养箱环境中进行。要选取处于对数生长期的细胞，此时细胞活力强，活力需达到 95% 以上，并且细胞形态呈现圆润、分散良好的状态。在融合前 1 – 2 天要对细胞进行传代，防止细胞老化，融合前还要用无血清培养基洗涤细胞 2 次，去除血清中可能影响融合的成分。

脾细胞制备：在末次免疫后的 3 – 4 天，是脾脏中抗原特异性 B 细胞数量最多的时候，此时进行取材。具体操作是在无菌条件下取出免疫小鼠的脾脏，用剪刀剪碎后，通过 200 目细胞筛研磨，得到单细胞悬液。接着将细胞悬液离心，转速 1500 rpm，时间 5 分钟，倒掉上清液，再用 PBS 或无血清培养基重新悬浮细胞，并进行细胞计数，一般一只 Balb/c 小鼠能获取 5×10⁷ – 10⁸个脾细胞。最后通过台盼蓝染色检测细胞活力，活细胞比例需达到 90% 以上才能用于融合。

02 细胞融合操作流程

细胞混合与离心：按照脾细胞和骨髓瘤细胞 5:1 – 10:1 的比例进行混合，一般取 5×10⁷个脾细胞搭配 1×10⁷个骨髓瘤细胞。将混合后的细胞悬液进行离心，转速 1500 rpm，时间 5 分钟，离心后倒掉上清液，然后用吸管轻轻弹动管底，让细胞沉淀松散开，防止细胞结块影响后续融合效果。

PEG 诱导融合：先将 50% PEG 4000（分子量 4000，溶解在无血清培养基中，调节 pH 至 7.2 – 7.4）和无血清培养基预热到 37℃。在 37℃的环境下，用 1 mL 吸管在 1 分钟内缓慢滴加 1 mL 50% PEG 到细胞沉淀中，滴加过程中要轻轻旋转试管，让 PEG 均匀接触细胞，滴加完成后，在 37℃下静置 1 – 2 分钟，时间过长会增加细胞死亡率。

终止融合反应：在 1 – 2 分钟内，缓慢加入 5 mL 预热到 37℃的无血清培养基，边加边轻轻摇晃试管，逐步稀释 PEG，减轻它对细胞的毒性。随后以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟，倒掉上清液，用 HAT 培养基重新悬浮细胞，得到的融合细胞就是杂交瘤细胞，需要马上进行筛选。

03 融合后处理—— 铺板与筛选

将融合后的细胞悬液接种到 96 孔细胞培养板中，每孔加入 2 – 5×10⁴个细胞，保证后续 HAT 筛选时细胞有合适的密度。把培养板放入培养箱，使用 HAT 培养基培养细胞。在 HAT 培养基的筛选作用下，未融合的骨髓瘤细胞因为 HGPRT⁻/TK⁻无法利用补救途径合成 DNA 而死亡，未融合的脾细胞也会自然凋亡，只有杂交瘤细胞能够存活并增殖。培养过程中，每 2 – 3 天更换一次培养基，7 – 10 天左右就能看到杂交瘤细胞克隆形成。

细胞融合关键要点

细胞状态把控：骨髓瘤细胞必须处于对数生长期，活力达到 95% 以上，老化的细胞会降低融合成功率。制备脾细胞时，操作要轻柔，避免过度研磨造成细胞损伤，台盼蓝染色检测的死细胞率应低于 10%。

PEG 使用规范：PEG 的分子量选择 4000 较为合适，分子量过大细胞毒性高，过小融合效率低；浓度确定为 50%，需要现配并将 pH 值调节到中性；使用时要严格保持 37℃的温度，温度过低膜流动性差，过高则会损伤细胞。

操作细节注意：离心后要确保上清液完全倒掉，残留的培养基血清会影响 PEG 的作用。滴加 PEG 和终止液时，速度要缓慢、均匀，防止局部浓度过高导致大量细胞死亡。一般来说，细胞融合的效率在 1% – 10% 左右，也就是每 10⁶个骨髓瘤细胞能形成 10⁴ – 10⁵个杂交瘤细胞，实际经过 HAT 筛选后，阳性克隆的比例会更低，还需要后续的抗体检测来进一步验证。

除了 PEG 法，细胞融合还有电融合法和病毒融合法。电融合法是利用电脉冲使细胞膜穿孔后实现融合，它的优点是效率高、细胞毒性低，但需要专用设备，参数优化也比较复杂，适合大规模细胞融合研究；病毒融合法是借助仙台病毒包膜蛋白来介导膜融合，虽然效率高、特异性强，但病毒制备过程复杂，安全性较低，在早期研究中使用较多，现在已较少采用。

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