同源重组基因敲除技术与Cre-LoxP基因编辑技术的简要综述

 

来源公众号：生物清风岭　作者：莒地莒人 

基因编辑技术是生命科学研究中不可或缺的工具，其中同源重组基因敲除技术（Homologous Recombination-based Gene Knockout）和Cre-LoxP基因编辑技术作为两种经典且互补的技术手段，在基因功能研究、疾病模型构建、基因治疗等领域发挥了重要作用。

一、同源重组基因敲除技术

1. 基本原理

同源重组基因敲除技术基于DNA同源重组机制，通过外源DNA与宿主基因组中目标区域的同源序列发生重组，实现目标基因的敲除或替换。当外源DNA片段与宿主基因组中的目标区域具有高度相似的同源序列时，细胞内的修复体系（如真核生物中的HR途径）会促使两者之间发生重组，从而实现外源DNA对目标基因的替换或破坏，达到基因敲除的目的。

2. 核心步骤：

①目标基因选择：选定要敲除的关键基因。

②载体构建：设计含同源臂和筛选标记的打靶载体。

③细胞操作：培养胚胎干细胞（ES细胞）；通过电穿孔、显微注射或病毒感染等方法将载体转染至ES细胞；筛选成功转染的细胞。

④胚胎操作：将编辑后的ES细胞注入小鼠胚胎；移植至代孕母鼠子宫，培育出生。

⑤验证：PCR/Southern blot检测基因敲除；表型分析评估基因功能。

3. 优缺点

优点：精准性高，能够精确靶向特定基因位点；稳定性强，整合后的基因修饰可遗传；应用广泛，适用于细胞、动植物体系。

缺点：效率较低，自然状态下同源重组发生率低；技术周期漫长；对细胞类型有一定依赖，需使用具备HR活性的细胞。

4. 应用领域

基因功能研究：通过敲除特定基因，观察生物表型变化，揭示基因在生物发育、代谢或疾病中的作用。

疾病模型构建：如敲除肿瘤抑制基因构建癌症模型，或敲除致病基因模拟遗传病发病状态。

基因治疗研究：为探索基因缺陷的修复方案提供思路，验证潜在治疗靶点的可行性。

农业与生物工程：改良农作物性状，构建基因工程菌，服务于农业生产与生物技术开发。

二、Cre-LoxP基因编辑技术

1. 基本原理

Cre-LoxP系统是一种条件性基因编辑技术，由Cre重组酶和loxP位点组成。Cre重组酶能够特异性识别loxP位点，并在其之间进行切割和重组，从而实现基因的精确敲除、插入或替换。通过调控Cre酶的表达，可以实现对基因编辑的时空特异性控制。

2. 核心步骤

①细胞系准备：选择状态良好的细胞系（如HEK293）。

②载体构建：Cre重组酶表达载体；含LoxP位点的目的基因载体。

③细胞转染/感染：选择合适方法导入载体；优化转染/感染条件。

④基因编辑：Cre酶介导LoxP位点间DNA重组；实现基因敲除、敲入等编辑。

⑤验证：PCR/测序检测编辑准确性；蛋白水平检测表达变化。

⑥细胞筛选与表型分析：筛选标记筛选阳性细胞；单克隆化建立稳定细胞系；表型分析探究基因功能。

3. 优缺点

优点：灵活性高，可实现时间和空间特异性基因编辑；效率高，适用于多种生物模型。

缺点：需构建特异性Cre工具鼠和Flox小鼠，实验周期较长。

4. 应用实例

条件性基因敲除：在特定组织或发育阶段敲除目标基因，研究基因在特定条件下的功能。

癌症研究：利用Cre-LoxP技术开发癌症基因直接突变模型，简化研究流程。

神经系统研究：实现神经元回路的大规模可视化分析，揭示神经回路在行为和认知过程中的作用。

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