高中生物学 PCR 实验教学方法的优化与改进

 

来源公众号：生物学通报　作者：罗淋淋

文章来源：罗淋淋.高中生物学 PCR 实验教学方法的优化与改进[J]. 生物学通报, 2025, 60(3): 55-57.

高中生物学 PCR 实验教学方法的优化与改进

罗淋淋（广东省深圳市红山中学）

摘 要 结合教学实践对原实验方案进行优化改进，通过快速 DNA 提取技术、优化 PCR 反应体系、缩短 PCR 反应时间及电泳时间，实现在单个学时内顺利完成从 DNA 提取到 PCR 反应及其产物的电泳检测实验。该实验方法能够大幅度缩短本课程所需要的时间，提高实践教学效果，适宜在教学过程中推广。

关键词 PCR DNA 电泳 高中生物学

DNA 提取、聚合酶链式反应（PCR）与琼脂糖凝胶电泳属于基因工程中获取目的基因的操作步骤。通常情况下，常规基因组 DNA 的提取所需时间为 3 h，PCR 反应所需时间为 1.5~2.0 h，琼脂糖凝胶电泳检测实验所需时间约 1 h。因此，完成从 DNA 提取到 PCR 反应及其产物的检测实验所需时间至少为 5.5 h，这对高中生物学课堂来说难以实现。因此，探究更加快捷高效的 PCR 实验教学方法是非常有必要的。

1  实验方法优化方案探究

1.1优化 DNA 提取方法，实现 DNA 的快速提取

目前，实验室常用的 DNA 提取方法包括十二烷基硫酸钠（SDS）法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法和使用 DNA 提取试剂盒等，这些方法较为繁琐、操作难度大、耗时过长，且部分试剂对人体有毒有害。此外，在提取过程 中产生大量废液造成环境的污染。因此，上述实验方法不适合在高中生物学的课堂开展。根据文献分析可知，现已报道多种优化的快速基因组提取方法，其中李琳等提出的“一种植物基因组 DNA 快速提取方法”能够高效、准确、适用性广地提取 DNA，该项技术可以引入高中生物学课程。 

提取步骤 ：取面积为 3~5mm²的水稻叶片 ，置于 1.5 mL 的 EP离心管中，加入 2 粒钢珠，将EP 管置于组织破碎仪中打碎样品（60 Hz，30 s）；或者可用研磨棒磨碎样品，至有绿色的组织液流出即可。向每个 EP 管中加入 200 μL DNA 提取液，本实验所使用 DNA 10× 提取缓冲液母液配制方法：100 mmol/L Tris（pH=9.5）、5 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）、5 mmol/L NaCl 和 1 mmol/ L KCl，用去离子水稀释至 1×即可使用。盖上 EP 管的盖子，上下颠倒几次，混匀。最后将 EP管置于离心机中 10 000 r/min 离 心 30 s，即完成了 DNA 的粗提过程，此过程耗时 2~3 min。本实验设置 3 个样本，1 号样本采用 CTAB 法提取 DNA 同时使用 3 个 DNA 样本进行下一步的 PCR 实验。

1.2优化 PCR 反应体系，高效完成 PCR 实验

PCR 技术广泛应用于临床医学和科研实验室，其基本原理为在体外模拟细胞内 DNA 复制的相关条件，并最终完成特定 DNA 片段的体外复制和扩增过程。该项技术主要分为变性、退火、延伸 3 个步骤：变性是使模板 DNA 双链解旋成为单链，以便与引物序列相结合；退火是在模 板变性成单链后，快速降温至退火温度，促进引物按照碱基互补配对的原则与单链模板 DNA 的互补序列相结合；延伸是在 Taq 酶的作用下，促进模板-引物沿着 5′→3′的方向合成一条与模板 DNA 链互补的链。 

本实验采用的 Taq 酶为 Vazyme 高纯度耐热 DNA聚合酶（2×Taq master mix，Dye Plus，P112-01）， 该混合体系包含 PCR 反应所需要的 DNA 聚合酶和缓冲液，反应时只需要加入引物和 DNA 即可。通过 NCBI 数据库检索获得水稻（Oryza sativa L.）primiR159 基因序列，并通过 Primer-BLAST 在线系统 检索获得引物序列pri-miR159-F 为 TCGGTCCAAAAAGGGGTGTT，pri-miR159-R 为 AGCATGGCGATAGAAGCAAC，选择目标基因的长度为 300 bp。为缩短实验时间并探究不同循环数对 PCR 反应扩增效率的影响，本实验对 1、2 和 3 号样本设置循环数分别为 25、30 和 35 个，总反应时间分别为 35、40 和 46 min。 

反应体系组成：2×Taq Master Mix（Dye Plus） 10.0 μL；引 物 pri-miR159-F（10 nmol /L）0.5 μL，引物 pri-miR159-R（10 nmol /L）0.5 μL；DNA 提取液 0.5~1.0 μL；双蒸水补足总体积 20.0 μL。 

PCR 反应条件为 95℃ 3 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 10 s；完成循环后最终 72℃ 3 min。在实验操作过程中，PCR 反应体系可根据样本来源和实验用途稍作调整。

1.3琼脂糖凝胶电泳检测方法

1.3.1 配制凝胶 

配制 1% 的琼脂糖凝胶，加入核酸染料［Vazyme，Ultra GelRed（10 000×），GR501- 01］，将胶液倒入电泳模具中静置约 20 min，将凝胶放入电泳槽时要注意电极极性。 

1.3.2 电泳及检测 

扩增后的 PCR 产物注入胶孔中 ，Maker 为 Vazyme DL2000 Plus DNA Marker （MD101-01）。为加快电泳检测的时间，实验设计 5、10 和 15 min，不同的电泳时间电压均为 160 V。电泳结束后使用荧光凝胶成像仪在电脑上观察电泳结果，并将结果存档。

2  结果与分析

2.1不同 PCR 循环数目的电泳检测结果及分析

检测了不同 PCR 的循环数目对实验结果的影响，结果如图 1 所示。在不同的 PCR 循环数下，3 组 PCR 产物的条带整齐单一，说明采用本实验方法 3 种 DNA 都能够扩增出目的基因片段。其中，与 1 号样本相比，样本 2 号和 3 号的条带较浅，说明：相比 CTAB 法提取的 DNA，快速提取法提取的 DNA 的 PCR 扩增效率较低。这种差异在 30 和 35 个循环时也存在，可能是快速 DNA 提取法的 DNA 模板浓度较低，后续 PCR 实验时可以适当增加快速 DNA 提取法中模板的量。通过该实验结果，得出结论：PCR 反应的循环数目为 30 个即可满足实验的需求，又能缩短反应所需要的时间。

2.2不同电泳时间检测结果及分析

分析图 1 可知，快速 DNA 提取法获得的 DNA 浓度较低。因此，在新一轮的 PCR 反应体系中，模板 DNA 的量增加为 2 μL（双蒸水的量减少 1 μL），而 CTAB 法提取的 DNA 的模板量仍为 1 μL。PCR 的循环数目为 30 个循环数，其余的反应体系和反应条件不变。为有效缩短凝胶电泳所需要的时间，提高实验效率，本实验探究了不同凝胶电泳时间下 PCR 产物的电泳结果，如图 2 所示。根据结果分析可得：在凝胶电泳时间为 5、10 和 15 min 时都能清晰地看到目的基因片段，随着电泳时间的增加，目的基因移动的距离越远。

文献报道不同的 DNA 提取方法对 DNA 的提取效果有影响，会影响浓度、纯度和 DNA 片段的 完整性。如图 2 所示，与 CTAB 法相比，快速 DNA 提取法的条带亮度较浅且随着凝胶电泳时间的推移，PCR 结果显示 3 组片段大小稍微有差异，说明快速提取 DNA 法提取的 DNA 浓度较低，且 DNA 完整性有一定的损失。高中生物学教学重点指导学生初步认识 DNA 提取和 PCR 技术，重在知识的理解和应用，不过度重于科学研究，所以本实验方法能够满足课程需要。根据实验结果得到结论：凝胶电泳时间为 5 min 即可满足实验需要。

3  结语

本实验通过快速 DNA 提取技术和优化的 PCR 反应体系，在 160 V 的电压下，电泳时间设 置为 5 min，最终可在 45 min 内完成 DNA 提取及 PCR 反应和电泳检测实验，且实验结果可满足高中学生实验需要。本实验方法能够使学生更好地理解和实践基因工程技术，有助于教师分配时间用于解释实验原理、总结实验结果，帮助学生提高分析、解决问题的能力，同时能够满足 PCR 与电泳实验的教学需求，达到提高实验教学的效果。 

本实验方法其他的优点：1）实验步骤简单易学，有助于零基础的高中生动手实践。2）减少实验过程中使用的试剂种类，特别是有毒试剂的使用，有效提高实验的安全性和可操作性。3）可应用的样本种类广泛，可操作性强。本实验方法可应用于探究性实验，鼓励学生主动探索科学。课后学生可将此套实验方法应用于检测不同物种的基因，或者检测基因在同一个物种的不同组织中的表达情况。在课上，学生认识并熟练掌握 DNA 提取、PCR 扩增和电泳检测等相关技术，能够有效掌握科学探究的一般流程，提高学生的综合实验技能、探究能力和创新精神。

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