【精准备考】酶切方法及酶切位点的选择

 

来源公众：生物侯老师

【相关知识】

1.酶切方法：单酶切和双酶切

(1)单酶切

①过程：先用同一种限制酶切割载体和含目的基因的DNA分子，获得带有相同黏性末端或平末端的片段。再通过DNA连接酶连接平末端或相同的黏性末端，获得重组质粒。

②缺点：单酶切时，目的基因和载体的所有接口都是相同的，所以容易出现目的基因反接或自身环化，如下图所示。

(2)双酶切

①过程：利用两个不同限制酶切割目的基因和载体，使目的基因和载体均具有两个不同的黏性末端，就可以避免反接，并减少自身环化的情况。

②方向：插入位置前后分别要有启动子和终止子，保证目的基因的表达。2.酶切位点选择

(1)不破坏目的基因和标记基因：若在目的基因、标记基因或其他重要结构上有某酶切位点，为避免这些结构被破坏，要避免使用相关的限制酶。

(2)根据T－DNA片段选择限制酶：若对Ti质粒进行操作，则酶切位点应位于T－DNA片段上，才能在农杆菌转化过程中将目的基因导入受体细胞基因组上。

(3)同尾酶的使用：同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。比如限制酶MboⅠ(↓GATC)和BamHⅠ(G↓GATC C)就是一对同尾酶，NotⅠ(GC↓GGCC GC)和Bsp120Ⅰ(G↓GGCC C)也是同尾酶。尽管同尾酶切割的黏性末端相同，可以被DNA连接酶连接，但是由于两端的序列不同，连接后的产物失去酶切位点，除非特殊情况，一般不会使用。  

【典例精析】

例1.(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是(　　)

A.若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同

B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因

C.若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否

D.若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落

答案：D

解析：若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。    

例2.(2024·河北邯郸模拟节选)植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与植物建立共生关系的一类微生物。

(1)某酵母菌能分泌一种可高效降解纤维素的酶，这种酶由W基因编码。为在放线菌中表达W基因，需以图中质粒为载体。W基因以乙链为转录模板链，转录时mRNA自身延伸的方向为________。

注：图中MfeⅠ与EcoRⅠ切割后产生的黏性末端相同，其余不相同。

①很多启动子具有物种特异性，在质粒中插入W基因，其上游启动子应选择________(填字母)。

A.酵母菌启动子    B.芽孢杆菌启动子

C.放线菌启动子

②应使用限制酶________切割图中质粒，使用限制酶________切割图中含W基因的DNA片段，以获得能正确表达W基因的重组质粒。

(2)利用PCR技术对放线菌是否含有W基因进行________水平鉴定，应根据目的基因(W基因)两端的碱基序列来设计________进行扩增。

答案：(1)5′→3′　①C　②MfeⅠ、HindⅢ　EcoRⅠ、HindⅢ　(2)分子　引物

解析：(1)转录时mRNA自身延伸方向为5′→3′。①该基因工程是将酵母菌的W基因导入放线菌，想让W基因在放线菌中成功表达，应当选择放线菌启动子。②按照选择限制酶的原则综合分析，MfeⅠ与EcoRⅠ切割后产生的黏性末端相同，但MfeⅠ会破坏目的基因，所以质粒使用限制酶MfeⅠ、HindⅢ切割，含W基因的DNA片段使用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ切割。    

(2)PCR技术是DNA分子的体外复制技术，属于分子水平。利用PCR技术扩增，应根据目的基因两端的碱基序列设计引物，使引物与模板链能特异性结合。

例3.(2024·河北邢台模拟)二十碳五烯酸(EPA)能促进体内饱和脂肪酸代谢，具有降低血液黏稠度、预防心脑血管疾病的功效。研究人员利用转基因技术从海洋生物中提取了EPA合成途径的关键基因pfaB，并将其导入酵母菌内，通过酵母菌发酵生产EPA。图1和图2分别是转基因过程中使用的含目的基因的DNA片段和质粒。回答下列问题：

(1)根据图1分析，利用PCR扩增pfaB基因时，所选用的引物是________。在PCR仪中进行n次循环，需要消耗________个引物。

(2)构建基因表达载体时，应选择______________这两种限制酶分别切割含目的基因的DNA和质粒，采用双酶切方法进行切割的目的是____________。

(3)据图2分析，将基因表达载体导入酵母菌后，可用添加了____________的培养基对目的基因成功导入并表达的酵母菌进行筛选。    

(4)采用PCR等技术可检测pfaB基因是否插入酵母菌染色体中，得到的PCR产物一般通过________________来鉴定，DNA分子的迁移速率与__________________有关。

答案：(1)引物5和引物4　2n＋1－2　(2)BamHⅠ和HindⅢ　避免目的基因和质粒自身环化，防止目的基因与质粒反向连接　(3)氨苄青霉素　(4)琼脂糖凝胶电泳　凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象

解析：(1)利用PCR扩增目的基因时，子链的延伸方向是5′端→3′端，扩增产物应该包含酶切位点序列，所以选用的引物为引物5和引物4。一个DNA分子经过n次复制形成2n个DNA，共含有2n＋1条链，除两条亲代的模板链外，剩下的每一条链的形成都需要消耗引物，所以需要消耗2n＋1－2个引物。

(2)图示分析：

结合图示分析可知，应选择限制酶BamHⅠ和HindⅢ分别切割含目的基因的DNA和质粒。采用双酶切的方法对含目的基因的DNA和质粒进行切割，可以避免目的基因和质粒的自身环化，防止目的基因与质粒的反向连接。

(3)由图2可知，四环素抗性基因会被限制酶破坏，因此筛选目的基因成功导入并表达的酵母菌时，可用添加氨苄青霉素的培养基培养酵母菌。

(4)采用PCR等技术检测pfaB基因是否插入酵母菌染色体中时，得到的PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。  

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