【精准备考】如何读懂质粒图谱及高频考点

 

来源公众号：生物侯老师

一、质粒图谱概述

质粒图谱是环状 DNA 分子的物理信息可视化展示，包含复制原点、筛选标记、多克隆位点、表达调控元件等关键信息。作为基因克隆与表达的重要工具，图谱解析是载体选择与实验设计的基础。

二、核心组成要素

1. 复制原点（Ori）
   • 原核质粒：单复制起点（如 pMB1）
   • 真核质粒：含 SV40 等真核复制信号
   • 穿梭质粒：双复制起点（如 ColE1+SV40）
2. 筛选标记系统
   • 抗生素抗性基因：Ampⁿ（氨苄）、Kanⁿ（卡那）、Neoⁿ（新霉素）
   • 营养缺陷型标记：Leu⁺、Trp⁺等（酵母载体常用）
3. 多克隆位点（MCS）
   • 特征：密集排列的单一酶切位点（如 EcoRI、HindIII）
   • 功能：外源基因插入窗口，通常位于启动子下游
4. 表达调控元件
   • 启动子：CMV（强）、T7（原核）、U6（RNAi）
   • 增强子 / 沉默子：位置不固定的转录调控序列
   • 终止子：polyA 信号（真核）、rho-independent（原核）

三、图谱解析要点

1. 方向性识别
   • 转录方向：启动子箭头（白色）指向基因编码区
   • 复制方向：Ori 箭头（黄色）指示 DNA 合成方向
   • 链区分：顺时针箭头对应正链（编码链），逆时针对应负链
2. 载体类型判断
   • 原核载体：单一 Ori + LacZα 筛选系统
   • 真核载体：含 Kozak 序列或内含子剪接信号
   • 病毒载体：含 LTR、包装信号等特征序列
3. 克隆可行性评估
   • 容量限制：常规质粒 < 10kb，BAC 可达 300kb
   • 酶切策略：选择 MCS 中未被其他元件占用的酶切位点
   • 表达效率：强启动子（如 EF1α）搭配优化的 UTR 序列

四、高级功能模块

1. 融合标签系统
   • N 端标签：His₆、GST（促进蛋白纯化）
   • C 端标签：Flag、HA（利于免疫检测）
   • 双向标签：IRES 连接双基因表达
2. 特殊功能元件
   • 荧光报告基因：EGFP、mCherry
   • 重组酶位点：loxP、FRT
   • 复制调控系统：严谨型（pSC101）/ 松弛型（pUC）

五、应用注意事项

1. 转化筛选时需匹配正确抗生素浓度
2. 大片段克隆建议使用低拷贝载体（如 pBR322）
3. 真核表达需验证 Kozak 序列完整性
4. 注意载体与宿主菌的基因型匹配（如 dam/dcm 甲基化）

六、图谱阅读技巧

1. 顺时针 / 逆时针箭头：表示不同 DNA 链的转录方向
2. 颜色编码：常用白色（启动子）、黄色（Ori）、蓝色（抗性基因）
3. 分子量标注：图谱边缘的数字代表 kbp 长度

七、高频考点

1. 限制酶选择与重组质粒构建
   • 双酶切优势使用两种不同限制酶切割质粒和目的基因，可避免质粒自连并确保插入方向正确。
   • 酶切位点选择优先选择 MCS 中未被其他元件（如启动子、抗性基因）占用的位点，同时考虑酶切后产生的黏性末端是否匹配。
   • 易错点若目的基因内部含所选限制酶的识别序列，则需调整酶切方案。
2. 筛选与检测方法
   • 抗生素筛选根据质粒抗性基因选择对应抗生素（如 Ampⁿ用氨苄青霉素），重组质粒若插入外源基因导致抗性基因失活，则无法在含该抗生素的培养基上生长。
   • 蓝白斑筛选利用 LacZα 基因（编码 β- 半乳糖苷酶），插入外源基因会破坏该基因，导致菌落呈白色（非重组菌落为蓝色）。
   • 分子检测PCR 验证（引物设计需跨插入位点）、酶切鉴定（双酶切后电泳观察片段大小）、测序确认。
3. 实验设计与结果分析
   • 目的基因表达验证通过 Western blot 检测目的蛋白，或通过荧光报告基因（如 EGFP）观察表达情况。
   • 对照实验设置需设置阳性对照（含已知目的基因的质粒）和阴性对照（未转化的宿主菌）。

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