细胞成像时需借助的技术和原理

 

作者：李林（厦门大学）

对特定组织进行成像，需要采集特定组织中的信号。同位素或荧光标记是不同类型的信号源，通过一定的技术手段，收集信号源释放出的信号，经过计算机处理，就可以获得特定组织的图像。

首先介绍同位素。元素由原子核和电子构成，原子核由质子和中子组成。同一种元素，具有相同的质子数，但可以具有不同的中子数。这种具有相同质子数，而具有不同中子数的元素，就称为同位素。其中，某些同位素的原子核结构不稳定，会自发释放能量，并最终达到稳定的状态，在能量释放的同时，该元素的质子数或者中子数发生变化，从而转变成另一种稳定的元素，这种不稳定的同位素称为放射性同位素。同位素标记法，就是采集放射性同位素向稳定的元素转化时释放的能量信号，进而得到有用的信息。

荧光标记主要应用到荧光染料和荧光蛋白。如图1所示，荧光染料和荧光蛋白通过吸收特定的激发光，其外层电子被激发，进入激发态，激发态物质的电子在回到基态的过程中，会以光的形式向外辐射能量，即为荧光。值得一提的是，由于绿色荧光蛋白的发现，3位科学家下村脩（Osamu Shimomura）、马丁·查尔菲（Martin Chalfie）和钱永健（Roger Tsien）于 2008 年获得了诺贝尔化学奖。而荧光染料将光学显微技术带入纳米尺度这一突破，使艾力克·贝齐格（Eric Betzig）、斯特凡·W·赫尔（Stefan W. Hell）和威廉姆·E·莫尔纳尔（W. E. Moerner）3位科学家被授予了2014年的诺贝尔化学奖。这足以证明，荧光标记与显微技术对人类发展的重要性。

单克隆抗体，是由单一B细胞克隆产生的高度专一、仅与某一特定抗原结合的抗体。可以将单克隆抗体理解为设定好坐标的“火箭”，而目标抗原，就是设定好的坐标。如图2所示，通过修饰单克隆抗体，将放射性同位素/荧光染料或荧光蛋白标记在抗体上，单克隆抗体这一“火箭”上，就安装了“探照灯”，当其到达含有目标抗原的特定组织时，与抗原结合，该特定位置被“点亮”，就可以通过仪器对该特定部位进行成像。

检测放射性同位素信号需要用到正电子发射断层扫描（positron emission tomography，PET）技术，通过PET成像，可以获得标记了放射性同位素的单克隆抗体与特定抗原结合位置的图像。这里涉及湮灭辐射的原理：放射性同位素会产生正电子，正电子与周围的负电子相互作用，会导致正负电子完全湮灭，同时释放出2个向相反方向运动的光子，这称为湮灭辐射。用相对放置的2个探测器来测量释放出的光子，称作湮灭符合探测。PET的探测器，将会收集光子的信号并生成被探测同位素分布的图像。如图3所示，以18F为例进行说明。18F具有9个质子和9个中子，其结构不稳定，会释放出一个正电荷从而变为18O。同时，释放出的正电子会与周围的负电子作用，释放出一对方向相反能量相同的光子，并以γ射线的形式释放出能量。使用PET采集这些信号，经过计算机处理，便可以得到图像。目前，PET广泛应用于临床疾病诊断，成为肿瘤、冠心病和脑部疾病最为有效的诊断和治疗手段。PET还常与CT结合使用，发挥更大的作用。

对荧光标记的单克隆抗体的检测，则需要借助荧光显微镜。普通的光学显微镜通过反光镜收集自然光照射样品，并通过目镜观察到放大的成像。荧光显微镜是将自然光源替换为汞灯，并通过滤光片来改变汞灯激发光的波长。当样本被荧光物质标记时，激发光激发荧光标记物发射出特定波段的荧光，通过目镜可以对样品的荧光信号进行观测。同时，可以通过荧光显微镜外接图像处理系统，采集样品的荧光发射信号，对被荧光标记的样品进行成像。为了获得更高分辨率的图像，可以使用激光扫描共聚焦荧光显微镜（laser scanning confocal microscope）。激光扫描共聚焦显微镜在荧光显微镜基本构造的基础上，采用能量可以调整的激光作为光源。如图4所示，

激光经由照明针孔，由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对样品焦平面上每一点进行扫描。荧光标记的组织样品，受到激发光的激发后发出的荧光经入射光的光路直接反向通过分光镜，通过探测针孔时先聚焦，通过针孔的荧光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，经过信号处理后在计算机显示器上显示图像。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，仅通过焦平面的光才会通过针孔，被PMT收集，因此称为“共聚焦”。相较于普通光学显微镜，共聚焦荧光显微镜因为有针孔的阻挡，仅收集焦平面上的荧光信号，因此具有更高的分辨率。通过物镜Z轴的移动，可以改变焦平面的位置，经过逐层扫描后信号叠加，可以实现组织的三维成像。相较于汞灯，激光器激发光的波段窄，可以同时激发多种激发光和发射光谱不同的荧光物质，获得不同被标记物独立的荧光信号，同时可以观测不同标记物之间的相互作用，获得更多的信息。激光扫描共聚焦显微镜在生物组织成像和病理学研究中具有广泛的应用，设计并开发具有优异性能的染料和荧光探针，也是目前重要的研究方向之一。

文章来源：李林.专家答读者问：细胞成像时需借助的技术和原理[J].生物学通报,2023,58(06):68-70.